張 靜 ，韋玉春＊＊，王國祥，楊 飛 ，程春梅，夏曉瑞

(1:南京師范大學虛擬地理環(huán)境教育部重點實驗室，南京210046)

(2:江蘇省環(huán)境演變與生態(tài)建設重點實驗室，南京210046)

藍藻是一類極其古老、微小的原核生物，具有極強的生態(tài)競爭優(yōu)勢.伴隨著富營養(yǎng)化，藍藻會大量生長與繁殖，形成水華，給水體水質(zhì)帶來嚴重的危害［1］.藻藍蛋白(phycocyanin，PC)在620 nm附近有一個吸收峰，是藍藻的特征色素蛋白之一［2］.在環(huán)境監(jiān)測中，特別是在藍藻水華頻發(fā)的水域，藻藍蛋白濃度能有效地表征藍藻生物量.準確提取水體中的藻藍蛋白，對藻藍蛋白濃度定量、藍藻水華監(jiān)測具有重要意義.

目前，實驗使用的藻藍蛋白的提取方法較多，常用的有反復凍融法、化學試劑處理法、溶脹法、超聲波法等［3-21］.典型研究如Padgett等［4］使用反復凍融法提取了銅綠微囊藻中的藻藍蛋白;曲文娟等［14］采用脈沖超聲輔助技術提取鈍頂螺旋藻中的藻藍蛋白;朱麗萍等［15］以溶脹法提取多管藻中的藻藍蛋白.但是，不同研究側(cè)重點不同，基于藻種不同，得到的結(jié)論存在差異.對于藻藍蛋白提取效果的評價，上述研究也主要基于提取液的藻藍蛋白濃度結(jié)果進行，較少做吸收光譜方面的分析研究，而吸收光譜是藻藍蛋白濃度定量的基礎［22］.此外，已有的藻藍蛋白提取研究多側(cè)重于實驗室內(nèi)培養(yǎng)的藻類.太湖是富營養(yǎng)化嚴重的渾濁水體，湖泊中藻種多樣，藻種結(jié)構(gòu)也具有明顯的時空差異［23］.因此，在使用上述方法提取太湖水體中的藻藍蛋白時需要做具體分析.

本文以2011年8月20日采集的太湖梅梁灣藍藻水華樣品為研究對象，選取反復凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法提取水樣中的藻藍蛋白.基于光譜吸收特征和藻藍蛋白濃度統(tǒng)計結(jié)果對各種提取方法進行評價，以期為太湖藍藻水華的監(jiān)測提供基礎支撐.

1 材料與方法

圖1 太湖梅梁灣采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Meiliang Bay of Lake Taihu

1.1 樣品采集

水樣采自太湖梅梁灣湖區(qū)表層30 cm水體，共12個樣點(圖1).采集日期為2011年8月20日.采樣期間天氣晴朗，風速為0.8～2.2 m/s.水樣采集后放入冷藏箱內(nèi)運回實驗室進行分析.

藻藍蛋白標準樣品購自美國Sigma公司，編號為P6161.

1.2 樣品準備

將野外采集的太湖水華溶液混勻，每種藻藍蛋白的提取方法分別平行采集相同體積的太湖樣品，采用1.2 μm孔徑的 Whatman GF/C濾膜真空泵抽濾，不同樣點采集的水樣水質(zhì)狀況不同，過濾體積稍有差異.以1#～12#表示各樣點水樣.

1.3 太湖藍藻水樣中藻藍蛋白的提取

分別參照下述方法提取1#～12#太湖藍藻水樣中的藻藍蛋白.每種提取方法設置3個平行樣.

反復凍融法［4］:將附著藻體的濾膜放入凍存管中，同時加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液于－20℃冰箱冷凍，然后室溫避光解凍，如此反復凍融7次.解凍的樣品以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為待測液.

超聲波法［14］:將附著藻體的濾膜置于超聲波儀中，以0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液為溶媒，超聲波處理20 min(功率800 W).超聲波處理結(jié)束后以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為待測液.

溶脹法［15］:將附著藻體的濾膜放入燒杯中，同時加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，在15℃的條件下溶脹提取，溶脹時間為3 d.提取結(jié)束后以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為待測液.

丙酮法［8］:將附著藻體的濾膜放入試管中，同時加入90%的丙酮抽提脂溶性色素，以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min.取上清液作為丙酮法的對比待測液，同時將剩余的藍色沉淀加一定量0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，置于磁力振蕩攪拌器上高速攪拌20 min，再以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為丙酮法的待測液.

1.4 標準樣品配置

使用0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，配置濃度為20、10、7、5、4、2、1 和 0.5 mol/L 的藻藍蛋白標準樣品系列，使用P1至P8表示.

1.5 藻藍蛋白濃度測定

使用島津UV-2450/UV-2550分光光度計測量各待測液和標準樣品的吸光度.分光光度計掃描波長為350～750 nm，分辨率為1 nm.

根據(jù)Bennett等［3］的公式求取藻藍蛋白濃度:

式中，藻藍蛋白濃度CPC的單位為mg/ml;A615、A652分別是藻藍蛋白在615、652 nm處的吸光度.

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析在SPSS 16.0軟件中進行.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取的藻藍蛋白吸收光譜結(jié)果

反復凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法提取的各樣品的藻藍蛋白吸收光譜如圖2，圖中各樣品的吸光度值以其平行樣的吸光度均值表示.

圖2 不同方法提取的藻藍蛋白吸收光譜Fig.2 Absorption spectrums of phycocyanin extracted by different methods

在350～750 nm的測量波長范圍內(nèi)，丙酮法藻藍蛋白提取液(圖2d)的吸收光譜形狀和吸收峰的位置與標準樣品(圖2f)一致.對比測量的丙酮上清液(圖2e)在波長430、480、620和670 nm處均具有吸收峰，且430、480和670 nm處吸收峰的峰高比620 nm強.反復凍融法(圖2a)、超聲波法(圖2b)、溶脹法(圖2c)的藻藍蛋白提取液在620 nm附近出現(xiàn)主吸收峰，其中，反復凍融法620 nm的峰高最強，超聲波法最弱.此外，反復凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的部分水樣的藻藍蛋白提取液在670 nm附近還具有次吸收峰，其位于650～700 nm區(qū)間的譜型特征與標準樣品存在差異.

表1 樣品中藻藍蛋白含量的變異系數(shù)Tab.1 Variation coefficients of phycocyanin concentration in different samples

2.2 不同方法提取的藻藍蛋白濃度結(jié)果

以Bennett等的公式計算各提取方法對應的1#～12#水樣的藻藍蛋白濃度值.由于不同點位的水質(zhì)狀況不同，水樣的平行樣的藻藍蛋白濃度均值具有差異.因而，文中使用變異系數(shù)(樣品平行樣的濃度值標準差與均值的比值)衡量不同方法提取的藻藍蛋白的差異性.變異系數(shù)如表1，平行樣的均值結(jié)果見圖3.反復凍融法、超聲波法不同水樣各個平行樣的變異系數(shù)均低于0.6(表1)，表明這兩種方法平行樣的結(jié)果具有較好的一致性，測量操作誤差較小.由不同方法提取的藻藍蛋白濃度比較結(jié)果(圖3)可知，反復凍融法提取的1#～12#太湖水樣的濃度值均高于其他3種方法，溶脹法次之，超聲波法的提取效果最不理想.

圖3 不同方法提取的藻藍蛋白濃度比較結(jié)果(T6和T8號太湖水樣的藻藍蛋白濃度較其他樣點高，為便于作圖比較，這兩個樣點的濃度值分別取其實際濃度值的1/10和1/20表示)Fig.3 Comparasion of the phycocyanin concentration under different extraction methods

3 討論

每種物質(zhì)都有自身的特征吸收光譜，吸收峰波長可以對已知物質(zhì)定性［22］.已有研究結(jié)果［3-21］表明，藻藍蛋白吸收峰位于620 nm附近.本文中反復凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法的藻藍蛋白提取液在620 nm附近具有吸收峰，反復凍融法620 nm的峰高最強，超聲波法最弱.這說明4種方法均能不同程度地提取出太湖藍藻水華樣品中的藻藍蛋白，其中，反復凍融法的提取效果優(yōu)于其他方法.反復凍融法(圖2a)、超聲波法(圖2b)、溶脹法(圖2c)獲取的部分水樣的藻藍蛋白提取液在670 nm附近還具有吸收作用，650～700 nm區(qū)間的譜型特征與標準樣品(圖2f)存在差異.這主要是由于反復凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的藻藍蛋白提取液均為粗提液，提取液中除了藻藍蛋白組分，還可能含有葉綠素蛋白復合體［7］、別藻藍蛋白［15］、細胞碎片［17］等物質(zhì)組分.這些物質(zhì)組分的存在會使得藻藍蛋白提取液的吸收光譜特征發(fā)生改變.余九九等［7］的研究結(jié)果表明，在以液氮凍融、超聲波破碎、蒸餾水低溫自溶、氯化鈣自溶4種方法提取出極大螺旋藻藻泥、藻粉中的藻藍蛋白的同時，鑲嵌于類囊體膜上的葉綠素蛋白復合體也會隨之脫落共存于提取液中，并對其670 nm附近的吸收光譜特性產(chǎn)生影響.本文中反復凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的部分水樣的藻藍蛋白提取液在670 nm附近出現(xiàn)吸收峰，說明用這3種方法提取太湖藍藻水華樣品中的藻藍蛋白時受到了葉綠素蛋白復合體的影響.此外，與反復凍融法、超聲波法、溶脹法，以及余九九等［7］研究中的蒸餾水低溫自溶、氯化鈣自溶等方法不同，丙酮法先以丙酮作為浸提溶劑破壞藻體細胞結(jié)構(gòu).丙酮為有機溶劑，能使脂溶性的葉綠素a從復合體上脫落下來且以色素的形式溶于其中［18］.故而，在丙酮上清液棄除、磷酸鹽緩沖液再懸浮后獲取的藻藍蛋白提取液的吸收光譜上，未出現(xiàn)葉綠素蛋白復合體位于670 nm附近［24-25］的吸收峰(圖2d).

以往的研究［12，14］已證實了超聲波法能有效地破碎藻類細胞，提取出樣品中的藻藍蛋白.但是本實驗中，無論是從圖譜分析還是計算濃度值的統(tǒng)計結(jié)果來看，超聲波法的提取效果均不理想，提取不完全現(xiàn)象嚴重.究其原因，主要受研究對象的影響.與室內(nèi)培養(yǎng)的純藻種樣品不同，野外采集太湖水樣中的藻體多以包裹體形式存在［26］.包裹體表面附有群體膠鞘［27］，破壁所需的超聲強度較室內(nèi)藻種大.此外，朱麗萍等［15］和尹興娟等［18］的研究表明，藻藍蛋白熱穩(wěn)定性差，在40℃即發(fā)生變性.增加超聲波作用的強度和延長作用的時間均會導致熱效應增加，使得細胞內(nèi)蛋白等有效組分的破壞.因此，在太湖藍藻水樣的藻藍蛋白提取中，單純用超聲波來破碎藻體細胞結(jié)構(gòu)是不夠的.

相較于超聲波法，溶脹法在620 nm藻藍蛋白特征峰處的峰值和相應的計算濃度值均有所提高，但其提取率仍低于反復凍融法.譚嘯等［23］的研究表明太湖水體中藻種眾多，藻種結(jié)構(gòu)具有明顯的時空差異.余九九等［7］、韋萍等［9］的研究證實不同藻種所需溶脹溶劑不同.因此，多藻種共存可能是溶脹法提取效果不理想的一個影響因素.從吸收光譜圖(圖2)來看，溶脹法在350～500 nm光譜區(qū)間的吸光度值衰減率高于其他方法.溶脹法提取周期長，提取過程中藻體一直與液態(tài)溶劑接觸，導致藻體細胞結(jié)構(gòu)破碎，產(chǎn)生的降解物增多，這可能是產(chǎn)生該差異的一個重要原因.此外，大量有機降解物的產(chǎn)生也會改變?nèi)芤旱膒H環(huán)境，使得藻藍蛋白活性降低［10］，反而不利于藻藍蛋白的提取.

丙酮法的藻藍蛋白提取液在670 nm附近未出現(xiàn)葉綠素蛋白復合體的吸收峰，但其在620 nm處的峰高低于反復凍融法和溶脹法.尹興娟等［18］的研究表明，藻藍蛋白由載體蛋白和藻藍素(發(fā)色團)組成.細胞結(jié)構(gòu)破碎后溶出的水溶性藻藍蛋白可溶于氯仿等有機溶劑中，變?yōu)橹苄缘脑逅{素.實驗中使用的丙酮為有機溶劑，能使脂溶性的色素溶于其中.因此，本文同時測量了丙酮法提取的丙酮上清液(圖2e)和再溶解后的藍色沉淀部分(圖2d)，并對其吸收光譜和濃度結(jié)果進行了比較.吸收光譜圖中(圖2)，兩種待測液均在620 nm附近出現(xiàn)吸收峰，且二者的吸收峰強度相當，說明丙酮法能提取出樣品中的部分藻藍蛋白，亦說明丙酮方法提取出的藻藍蛋白會以藻藍素的形式溶于丙酮而存在不同程度的損失.濃度統(tǒng)計結(jié)果(圖3)中丙酮法提取的藻藍蛋白濃度值小于反復凍融法和溶脹法也證明了這一點.此外，在丙酮法提取中，上清液和藍色沉淀的分離存在不確定性，藍色沉淀部分再溶解也存在不完全現(xiàn)象，均會對其提取測量的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響.

吸收光譜的圖譜分析結(jié)果(圖2)和藻藍蛋白濃度計算結(jié)果(圖3)均表明，反復凍融法的提取效果明顯優(yōu)于其他方法.反復凍融法主要通過細胞內(nèi)冰粒的形成和剩余細胞液鹽濃度的增高引起溶脹，使細胞壁、細胞膜破碎，藻膽體內(nèi)的藻藍蛋白溶出.李冰等［12］的研究指出，藻藍蛋白在低溫狀態(tài)下具有較好地穩(wěn)定性.因此，當樣品中存在包裹體且藻類組成不同時，可以通過增加反復凍融次數(shù)和降低凍融溫度的方式來提高提取率.此外，藻體在反復凍融提取的大部分時間里均處于結(jié)凍狀態(tài)，細胞結(jié)構(gòu)破碎降解產(chǎn)生有機質(zhì)的含量較溶脹法小，pH環(huán)境穩(wěn)定，易于保持藻藍蛋白的活性.但是，與超聲波法、溶脹法類似，在細胞結(jié)構(gòu)破碎藻藍蛋白溶出的同時，位于類囊體膜上的葉綠素蛋白復合體也同時釋放出來.從吸收光譜圖(圖2)來看，葉綠素蛋白復合體位于670 nm附近的吸收峰對650 nm處的吸光度產(chǎn)生了影響.考慮到常用的藻藍蛋白濃度計算公式［3，5］中定義的650 nm處吸光度為別藻藍蛋白的吸收，因此，在以后的研究工作中，還需要開展更多的實驗對比工作來分析葉綠素蛋白復合體對太湖水樣中藻藍蛋白提取的影響.

綜上所述，反復凍融法的提取效果明顯優(yōu)于其他方法，可推薦作為一種太湖藍藻水樣中藻藍蛋白的實驗室提取方法.

致謝:太湖水樣采集得到了南京師范大學地理科學學院研究生王磊、孫曉鵬、周宇的幫助，藻藍蛋白的提取實驗得到了南京師范大學生命科學學院李建宏教授的指導以及研究生夏明升的幫助，在此表示衷心感謝.

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