李秋陽，陳惠麗，李 寧，吳 芳，田 陳，蘇春祥，王梓禎

（首都醫(yī)科大學(xué)電力教學(xué)醫(yī)院 病理科，北京100073）

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，其浸潤性生長的生物學(xué)特性是治療不佳的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶9（Martix Metalloproteinase 9，MMP－9）是金屬蛋白酶中具有代表性的主要成員之一，目前很多學(xué)者在多種腫瘤中已證實(shí)惡性腫瘤細(xì)胞通過金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)以突破組織屏障而發(fā)生轉(zhuǎn)移。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶－張力蛋白基因（PTEN）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的堿性磷酸酶家族中第一個(gè)腫瘤抑制基因，位于人類染色體10q23，研究發(fā)現(xiàn)，在人類多種腫瘤中該基因發(fā)生突變。PTEN蛋白是定位于細(xì)胞質(zhì)的磷酸酶，在腫瘤細(xì)胞的分化、浸潤、轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)起重要作用。

本研究利用組織芯片和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測MMP－9和PTEN在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)，并探討它們的意義和相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 67例膠質(zhì)瘤標(biāo)本來自2000年1月至2004年9月北京電力醫(yī)院神經(jīng)外科收治的患者，經(jīng)手術(shù)切除術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)瘤。其中男性41例，女性26例，年齡15－68歲，平均年齡（43.6＋－11.5歲）。按照WHO2000中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)：2級(jí)31例，3級(jí)11例，4級(jí)25例。正常腦組織標(biāo)本8例，取自同期經(jīng)手術(shù)切除病理診斷為腦膿腫病例。

1.2 組織芯片的制備 腫瘤標(biāo)本常規(guī)固定、包埋、切片及HE染色，光學(xué)顯微鏡下選擇能夠代表腫瘤特點(diǎn)的目標(biāo)組織區(qū)域，分別在組織切片和相應(yīng)的蠟塊上標(biāo)記。

1.2.1 組織芯片蠟塊的制作 運(yùn)用組織芯片手動(dòng)制作儀細(xì)針打孔的方法制作芯片［1，2］，先在空白蠟塊上鉆孔，直徑為2mm，再用金屬空心針（內(nèi)徑為2 mm）從經(jīng)定位的目標(biāo)蠟塊上鉆取組織（一般深度為2－3毫米），并轉(zhuǎn)移到已鉆孔的空白蠟塊的相應(yīng)位置，每例組織取一個(gè)位點(diǎn)，如此反復(fù)將所有標(biāo)本整齊有序地安插在空白蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。制成的兩個(gè)組織芯片均為8×5點(diǎn)陣，起始處用1例睪丸組織定位?？偣舶?7例腫瘤組織和8例正常腦組織。如圖1所示。

1.2.2 組織芯片蠟塊切片 與常規(guī)組織切片相同，切片厚度為4微米，使用APES載玻片，置于4度冰箱保存。如圖1所示。

圖1 組織芯片蠟塊和經(jīng)HE染色的組織芯片切片

1.3 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)采用En－Vision法。選用的一抗有鼠抗人MMP－9、PTEN多克隆抗體及PV6001、DAB顯色試劑盒。以上均購自中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司。組織芯片常規(guī)脫蠟、水化，室溫下3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶5分鐘；100度高溫、pH6.0檸檬酸修復(fù)15分鐘；滴加鼠抗人多克隆抗體（抗體稀釋度1∶100）；滴加PV6001試劑；DAB顯色，復(fù)染后脫水、透明、封片。試劑公司提供的陽性對(duì)照作為陽性對(duì)照，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) MMP－9和PTEN蛋白主要定位于細(xì)胞漿，其陽性信號(hào)均為棕黃色顆粒。采用復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提出的判斷標(biāo)準(zhǔn)，首先將著色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕黑色。再按陽性細(xì)胞的百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%－50%為2分，51%－75%為3分，＞75%為4分。將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比乘積作為標(biāo)準(zhǔn)：0－3分為“－”，4－6分為“＋”，7－9分為“＋＋”，10－12分為“＋＋＋”。如圖2所示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5for windows統(tǒng)計(jì)軟件，非腫瘤組和腫瘤組組間 MMP－9、PTEN表達(dá)情況的比較采用卡方檢驗(yàn)，不同病理分級(jí)組別MMP－9、PTEN 表達(dá)情況比較采用 Kruskal－wallis秩和檢驗(yàn)，MMP－9、PTEN之間的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，以P＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 MMP－9和PTEN蛋白免疫組化染色（EnVision法，400×）

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

本研究制作包括8例正常腦組織和67例膠質(zhì)瘤的組織芯片。免疫組織化學(xué)陽性信號(hào)為棕黃色顆粒，MMP－9、PTEN蛋白主要定位于胞漿。

2.2 正常腦組織和不同 WHO級(jí)別膠質(zhì)瘤的PTEN表達(dá)情況。

8例正常腦組織中PTEN全部表達(dá)，陽性率為100%。67例膠質(zhì)瘤中33例呈陽性表達(dá)（49.25%），經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)證實(shí)正常組和腫瘤組之間PTEN的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中31例WHO2級(jí)膠質(zhì)瘤PTEN－ ～＋＋＋表達(dá)百分率 分 別 為 41.94%、38.7%、19.35%、0，11 例WHO3級(jí)膠質(zhì)瘤PTEN－ ～＋＋＋表達(dá)百分率分別為54.55%、36.36%、9.09%、0，25例 WHO4級(jí)膠質(zhì)瘤PTEN－ ～＋＋＋表達(dá)百分率分別為60%、32%、8%、0，發(fā)現(xiàn)WHO級(jí)別越高的膠質(zhì)瘤其PTEN表達(dá)下降，經(jīng)Kruskal－Wallis秩和檢驗(yàn)證實(shí)各級(jí)別間的PTEN表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 8例正常腦組織及67例不同WHO級(jí)別膠質(zhì)瘤中PTEN的表達(dá)

2.3 正常腦組織和不同 WHO級(jí)別膠質(zhì)瘤的MMP－9表達(dá)情況。

8例正常腦組織中有7例呈MMP－9陽性表達(dá)，陽性率為75%。67例膠質(zhì)瘤中62例呈陽性表達(dá)（92.5%），經(jīng)卡方檢驗(yàn)證實(shí)，正常組和腫瘤組之間MMP－9的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中31例WHO2級(jí)膠質(zhì)瘤MMP－9－ ～＋＋＋表達(dá)百分率分別為9.68%、32.26%、35.48%、22.58%，11例WHO3級(jí)膠質(zhì)瘤MMP－9－～＋＋＋表達(dá)百分率分別為18.18%、36.36%、45.45%、0，25例 WHO4級(jí)膠質(zhì)瘤MMP－9－ ～＋＋＋表達(dá)百分率分別為0、24%、56%、20%，發(fā)現(xiàn)WHO級(jí)別越高的膠質(zhì)瘤其MMP－9表達(dá)增強(qiáng)，經(jīng)Kruskal－Wallis秩和檢驗(yàn)證實(shí)各級(jí)別間的MMP－9表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 8例正常腦組織及67例不同WHO級(jí)別膠質(zhì)瘤中MMP－9的表達(dá)

2.4 膠質(zhì)瘤中MMP－9與PTEN表達(dá)相關(guān)性

67例膠質(zhì)瘤MMP－9和PTEN的表達(dá)情況如表3。經(jīng)Spearsman相關(guān)分析證實(shí)，MMP－9的表達(dá)與PTEN的表達(dá)無相關(guān)性（P＞0.05）。

表3 67例膠質(zhì)瘤中MMP－9與PTEN的表達(dá)關(guān)系

3 討論

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，其主要特征呈浸潤性生長、容易復(fù)發(fā)。時(shí)至今日膠質(zhì)瘤的治療仍然是神經(jīng)外科領(lǐng)域的重大難題。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程涉及腫瘤細(xì)胞黏附、基質(zhì)降解、細(xì)胞遷移等許多環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤的浸潤和侵襲過程中起著關(guān)鍵作用。膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以分泌蛋白水解酶降解、破壞由細(xì)胞間質(zhì)組成的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。因此，了解腫瘤細(xì)胞浸潤機(jī)制將有可能為膠質(zhì)瘤的治療帶來突破性進(jìn)展。

基質(zhì)金屬蛋白酶（Martix Metalloproteinase，MMPs）是蛋白水解酶中較為重要的一類，它們通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲。目前普遍認(rèn)為，MMPs涉及惡性腫瘤相關(guān)的多個(gè)過程，包括腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及腫瘤的增殖［3］。其中 MMP－9是分子量為92kDa的明膠酶B，由巨噬細(xì)胞、結(jié)締組織和某些腫瘤細(xì)胞合成分泌，與組織發(fā)生、傷口愈合以及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MMP－9在膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)率（92.62%）高于正常腦組織（75%），但統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)沒有顯著性差異（P＞0.05），我們考慮可能由于實(shí)驗(yàn)納入的正常腦組織樣本過少有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)隨著膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別的升高，MMP－9表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），這說明 MMP－9的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的侵襲性密切相關(guān)。有研究表明，應(yīng)用Northern blotting和免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)臨床組織標(biāo)本檢測表明，膠質(zhì)瘤中存在MMP－9的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)并隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增高其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平亦明顯增加，提示膠質(zhì)瘤的侵襲性與其MMPs表達(dá)與活化有密切關(guān)系［4－5］。

PTEN是具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，研究發(fā)現(xiàn)，在人類多種腫瘤中該基因發(fā)生突變。PTEN蛋白定位于胞漿，主要功能區(qū)位于N端，是酶的催化中心。PTEN的腫瘤抑制作用主要依賴其脂質(zhì)磷酸酶活性，但其蛋白磷酸酶活性仍可以影響細(xì)胞增殖、黏附和細(xì)胞遷移［6－8］。大量研究表明，PTEN在許多腫瘤中表達(dá)缺失，在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中起到一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在膠質(zhì)瘤的陽性表達(dá)率（49.25%）明顯低于正常腦組織（100%）（P＜0.05），提示PTEN基因突變或丟失、滅活在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中起到重要作用。本研究還提示，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，PTEN蛋白陽性表達(dá)降低（P＜0.05），提示PTEN基因異常與膠質(zhì)瘤惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相同［9］。因此我們推斷PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失在由低度惡性膠質(zhì)瘤向高度惡性膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)化過程中起著十分重要的作用。

膠質(zhì)瘤是一種多種基因異常的疾病，癌基因的激活和過表達(dá)及抑癌基因的突變、缺失使腫瘤逃避正常生長調(diào)控機(jī)制而失控增殖［10］。因此有必要聯(lián)合多種基因來細(xì)分研究。文獻(xiàn)報(bào)道PTEN主要通過調(diào)節(jié)P130蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子的活性影響腫瘤細(xì)胞的增長、侵襲等生物學(xué)行為。我們知道PTEN基因表達(dá)異常與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其能通過影響FAK的磷酸化在腫瘤的浸潤、血管生成過程中起作用，能夠影響細(xì)胞局部黏附和運(yùn)動(dòng)遷移能力。Hwang發(fā)現(xiàn)，PTEN可以調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，67例膠質(zhì)瘤中，MMP－9與PTEN的表達(dá)沒有相關(guān)性（P＞0.05），因此我們的研究結(jié)果尚不能支持MMP－9異常激活與PTEN基因表達(dá)缺失有密切關(guān)系這一判斷。PTEN基因表達(dá)下調(diào)與MMP－9異常激活的相關(guān)性有待于多種技術(shù)方法進(jìn)一步闡明。

本研究結(jié)果提示，MMP－9和PTEN在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，MMP－9的高表達(dá)和PTEN的表達(dá)下降提示膠質(zhì)瘤的侵襲性增高，兩種指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用可作為膠質(zhì)瘤病理分級(jí)診斷及判斷預(yù)后的重要參考依據(jù)。

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