王玲玲，高 申，孫 莉，趙海豐，宋麗娜，師慶紅，王 海，郭宏華，何成彥

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第二臨床學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130041；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院）

大腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，是多種致癌因素共同作用發(fā)生的惡性病變。在全世界范圍內(nèi)，大腸癌是第三大惡性腫瘤，其病死率占全部癌癥的第二位［1］。大腸癌的發(fā)生發(fā)展與基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，涉及ras、myc等原癌基因的激活和APC、MCC、P53、P73等抑癌基因的失活。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，關(guān)于大腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和腫瘤標(biāo)記物的研究進(jìn)展迅速。本研究針對(duì)大腸癌組織、癌旁組織和健康對(duì)照三組樣本，選取MCC、Survivin、P73和RhoA等四種基因進(jìn)行檢測(cè)，探討以上指標(biāo)與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為大腸癌發(fā)病機(jī)制的研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 對(duì)象 選取吉林大學(xué)第二醫(yī)院就診的大腸癌患者癌組織和癌旁10cm以外的正常組織作為檢測(cè)對(duì)象，癌組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)為Dukes A期；對(duì)照組為20例取自因腹部外傷時(shí)的健康人的正常結(jié)腸組織。所有病例均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審校批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取100mg組織樣品，加入1 ml的TRIZOL試劑，勻漿。勻漿后樣品于15－30℃孵育5min，加入0.2ml的氯仿，振蕩15秒，15－30℃孵育2－3min；4℃，12 000r／min離心15分鐘。RNA沉淀：將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入0.5ml的異丙醇，混勻后15－30℃孵育10min；4℃，12 000 r／min離心10min。移去上清液，加入1ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀，振蕩；4℃，7 500r／min離心5分鐘。在空氣中干燥RNA沉淀5－10min。加入無(wú)RNA酶的水，反復(fù)吹打幾次，55－60℃孵育10 min，獲得的RNA溶液保存于－70℃。

1.2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè) 采用變性瓊脂糖凝膠電泳來(lái)觀察RNA的質(zhì)量。其具體步驟如下：將1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C，加入10ml的10×MOPS電泳緩沖液和18ml 37% 甲醛溶液；灌制凝膠板，膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的MOPS電泳緩沖液；取5μl RNA，加等體積的2×甲醛上樣染液，再加入少量EB；上樣，在5–6V／cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2－3 cm；紫外透射光下觀察并拍照，28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的亮度大約是下面一條帶的2倍。

1.2.3 cDNA合成 按以下條件配制反應(yīng)液：buffer 2μl，上游引物（TAKARA公司設(shè)計(jì)）0.2μl，下游引物（TAKARA 公司設(shè)計(jì)）0.2μl，dNTP 0.1 μl，逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 MMLV（TAKARA 公 司）0.5μl，DEPC水5μl，RNA模版2μl，混勻，6 000rpm 瞬時(shí)離心。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘；取出后立即95℃干浴3分鐘，得到cDNA溶液，保存于－80℃待用。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR SYBR Green 1染料（TAKARA公司）10μl，上游引物F 0.5μl，下游引物R 0.5μl，dNTP 0.5μl，Taq酶1μl，模板DNA 5 μl，ddH2O 32.5μl，總體積 50μl；混勻，6 000rpm瞬時(shí)離心，于Real time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序設(shè)定：第一步：93℃2min，第二步：93℃1 min，55℃ 1min，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，第三步：72℃7min。PCR反應(yīng)完后，取PCR產(chǎn)物跑2%瓊脂糖凝膠電泳，并加DNA Ladder作為參考，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶；用軟件分析數(shù)據(jù)，記錄反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度CT值，以GAPDH為內(nèi)參，2－△△CT法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 MCC、Survivin、P73、RhoA和內(nèi)參基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，將P＜0.05設(shè)為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁組織和健康人結(jié)腸組織（P＜0.01），而在癌旁和健康對(duì)照組中表達(dá)變化不大；4種基因在癌組織、癌旁組織和健康對(duì)照組中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。

圖1 Real time PCR檢測(cè) MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌中的表達(dá)

3 討論

MCC基因編碼829個(gè)氨基酸，是1991年由Kinzler等人發(fā)現(xiàn)的，其與早期直結(jié)腸癌有密切關(guān)系。Fukuyama等［2］在研究鋸齒狀結(jié)腸癌時(shí)，發(fā)現(xiàn)MCC可能是一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子，它可以抑制Wnt／β－連鎖蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近年來(lái)，關(guān)于MCC突變的研究較多，其突變發(fā)生于大腸癌早期［3］；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MCC基因在大腸癌及癌旁組織的突變率與正常組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而癌組織與癌旁之間差異無(wú)顯著性［4］。本研究顯示，MCC在大腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁及健康對(duì)照組，而癌旁與健康對(duì)照之間表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)MCC突變及表達(dá)情況，我們可以了解到其在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Surivin基因長(zhǎng)度14.5kb，含有4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子；Surivin是凋亡抑制蛋白家族成員之一，可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤增殖、誘導(dǎo)血管生成。Surivin分布具有組織特異性，在正常成人組織的表達(dá)僅見(jiàn)于胸腺、睪丸和分泌期的子宮內(nèi)膜；在大多數(shù)腫瘤組織中有高表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、骨肉瘤和淋巴瘤［5］。Survivin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)［6］。P73基因是Kaghad等在1997年發(fā)現(xiàn)的，定位于1p36.2－36.3，與P53在結(jié)構(gòu)和功能上有相似性。P73過(guò)表達(dá)能夠激活P53的靶基因，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。P73高表達(dá)預(yù)示臨床預(yù)后較差，提示其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。Rho家族主要包括 Rho（A、B、C）、Rac和cdc42三個(gè)亞家族，其中RhoA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。有學(xué)者對(duì)小鼠骨癌模型進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，RhoA參與癌性骨痛的發(fā)展過(guò)程［8］。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者體內(nèi)RhoA不僅表達(dá)高，而且與埃茲蛋白的表達(dá)機(jī)制有關(guān)，為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)［9］。

本研究結(jié)果顯示，MCC、Survivin、P73和RhoA在癌組織高表達(dá)，表明它們?cè)诖竽c癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，相信我們會(huì)對(duì)越來(lái)越多的基因促進(jìn)大腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有更深一步的了解，從而為大腸癌發(fā)病機(jī)制和基因干預(yù)治療的進(jìn)一步研究奠定理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Koh Miura，Wataru Fujibuchi，Michiaki Unmo.Splice isoforms as therapeutic target for colorectal cancer［J］.Carcinogenesis，2012，33（12）：2311.

［2］Ryuichi Fukuyama，Roxana Niculaita，Kwok Peng，et al.Mutated in Colorectal Cancer，a Putative Tumor Suppressor for Serrated Colorectal Cancer，Selectively Represses β－catenin－Dependent Transcription［J］.NIH－PA Author Manuscript，2008，27（46）：6044.

［3］黃 萍.大腸癌相關(guān)基因改變的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2003，30（1）：44.

［4］朱理瑋，章志翔，王鵬志，等.大腸癌中 MCC和APC基因突變檢測(cè)及臨床意義［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1999，16（3）：201.

［5］Waliqorska－Stachura J，Jankowska A，Wasko R，et al.Survivinprognostic tumor biomarker in human neoplasms－review ［J］.Ginekol Pol，2012，83（7）：537.

［6］Thilo Sprenger，F(xiàn)ranz Rodel，Tim Beissbarth，et al.Failure of downregulation of surviving following neoadjuvant radiochemotherapy in rectal cancer is associated with distant metastases and shortened survival［J］.Clinical Cancer Research，2011，17（6）：1623.

［7］Ramadan S，Terrinoni A，Catani MV，et al.p73induces apoptosis by different mechanisms［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，331：713.

［8］Hang LH，Shao DH，Chen Z，et al.Spinal RhoA／Rho Kinase Signaling Pathway may Participate in the Development of Bone Cancer Pain［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2013，Mar 22.doi：10.1111／bcpt.12069.［Epub ahead of print］.

［9］Ma L，Liu YP，Zhang XH，et al.Relationship of RhoA signaling activity with ezrin expression and its significance in the prognosis for breast cancer patients［J］.Chin Med J（Enql），2013，126（2）：242.