劉燕文，魯 凱，賈建英，葉紅玲，姜維美

（連云港市第二人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，江蘇 連云港222023）

鉑類是大腸癌患者最常用的化療藥物，但在不同種族人群中、不同個體間仍有顯著的化療有效率／毒性反應(yīng)，目前應(yīng)用的抗腫瘤藥物對至少70%的患者療效有限，20%－40%的患者甚至有可能接受了錯誤的藥物治療［1］，因此對腫瘤藥物的療效預(yù)測成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。乳腺癌易感基因家族（breast cancer susceptibility gene BRCA）通過基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA重組修復(fù)等發(fā)揮腫瘤抑制功能及參與DNA修復(fù)，其功能失活與散發(fā)性乳腺癌、卵巢癌發(fā)生有關(guān)。近來的研究顯示BRCA－1與紫杉類及鉑類藥物療效相關(guān)，是提示預(yù)后及化療療效的預(yù)測分子［2，3］。錯配切除修復(fù)蛋白（excision repair cross complement1ERCC1）是DNA修復(fù)途徑中最主要的基因之一［4］，目前研究表明其mRNA或蛋白低表達(dá)與鉑類為基礎(chǔ)的非小細(xì)胞肺癌化療的總生存時間延長存在明顯的相關(guān)性［5］。因此，我們采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－qPCR）檢測大腸癌患者的石蠟包埋組織中 BRCA－1mRNA、ERCC－mRNA 表達(dá)，研究其與臨床病理特征及與預(yù)后的關(guān)系，為大腸癌患者個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2005年07月至2010年10月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實、資料完整的大腸癌患者54例，其中，男34例，女20例，中位年齡65歲（44－78歲）。臨床分期按第七版AJCC腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)，其中臨床Ⅰ、Ⅱ期30例，Ⅲ期8例，Ⅳ期16例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，所有患者均在我院接受化療并有完整的隨訪資料，隨訪時間至2012年10月，化療方案采用以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的方案（表1）。

1.2 治療方法 mFOLFOX方案：奧沙利鉑85 mg／m2第1天，亞葉酸鈣400mg／m2第1天，5－氟尿嘧啶400mg／m2靜推第1天，繼5－氟尿嘧啶2 000mg／m2CIV46小時，雙周方案，共六周期。

1.3 臨床觀察及評價 主要觀察指標(biāo)總生存時間（overall survival，OS），次要觀察指標(biāo)至腫瘤進(jìn)展時間（Time－To－Progression TTP）?？偵鏁r間為從確診之日起（手術(shù)日）至末次隨訪或死亡（死于原發(fā)腫瘤或并發(fā)癥）的時間。至腫瘤進(jìn)展時間為從首次化療到病人出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的時間。

1.4 主要試劑及儀器

實時熒光定量PCR儀（7900HT Fast）購自美國ABI公司 ；核酸蛋白檢測儀（Eppendorf Biophotometer plus）購自德國艾本德公司；石蠟RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Qiagen公司；熒光染料購自美國AB公司；引物由上海生工公司合成。

1.5 實驗方法

1.5.1 SYBR Green RT－qPCR 檢 測 BRCA－1mRNA表達(dá)按照試劑盒說明提取石蠟RNA（RNase－free FFRE Kit，Qiagen），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT反應(yīng)體系10μl：gDNA：1μl，2μl RNA和4μl DEPC－H2O 42℃ 2min，然后加入0.5μl Primer（10nmol／μl），0.5μl RT 酶，Buffer：2μl，42℃30min，95℃5min。上機(jī)進(jìn)行檢測，定量PCR反應(yīng)體系：Master Mix：2.5μl，模板cDNA 1 μl，上下游引物各0.25μl（20pmol／μl），H2O 1μl，（5μl體系）。反應(yīng)條件：94 ℃30s，60 ℃1min，68℃2min，40個循環(huán)，最后68℃7min。利用軟件分析其Ct值，與其對應(yīng)的Beta－actin基因的量進(jìn)行校正，CUT OFF值取實驗室質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)值BRCA－1 6.5，ERCC4.8，小于CUT OFF值定義為低表達(dá)，大于等于CUT OFF值定義為高表達(dá)。

1.5.2 引物的設(shè)計和合成 根據(jù)GeneBank報道的人ERCC－1，BRCA－1基因cDNA設(shè)計引物如下：

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，采用COX回歸法進(jìn)行多因素分析，生存分析采用Kaplan－Meier法，生存率的比較采用Log－rank法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRCA－1mRNA結(jié)果 所有大腸癌組織中均有BRCA－l mRNA 表達(dá)，其 RT－qPCR 體系無非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)穩(wěn)定，重復(fù)性好。54例大腸癌患者中，BRCA－1mRNA低表達(dá)20例（37.04%），高表達(dá)34例（62.97%）。BRCA－1mRNA 表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.034；P＝0.037）。

2.2 BRCA－1mRNA表達(dá)水平與54例患者總生存時間的關(guān)系 BRCA－1低表達(dá)水平組：中位生存時間 MST（47.84月）；BRCA－1高表達(dá)水平組：中位生存時間 MST（35.36月），二者無統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.137）（表2，圖1）。

2.3 BRCA－1mRNA表達(dá)水平與16例晚期大腸癌患者總生存時間及至腫瘤進(jìn)展時間的關(guān)系 總生存時間：BRCA－1mRNA 高表達(dá)患者（32.6月）長于低表達(dá)患者（9.5月，P＝0.026）；至腫瘤進(jìn)展時間：BRCAmRNA高表達(dá)患者（10.3月）長于低表達(dá)患者（4.3月，P＝0.026）（表3）。

2.4 ERCCmRNA結(jié)果 所有大腸癌組織中均有ERCCmRNA表達(dá)，其RT－qPCR體系無非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)穩(wěn)定，重復(fù)性好。54例大腸癌患者中，ERCCmRNA低表達(dá)14例（25.93%），高表達(dá)40例（74.07%）。ERCC1mRNA表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為無關(guān)（P＞0.05）。

2.5 ERCCmRNA表達(dá)水平與54例患者總生存時間的關(guān)系 ERCC低表達(dá)水平組：中位生存時間MST（49.50月）高于低表達(dá)患者（30.33月，P＝0.014）。

2.6 ERCCmRNA表達(dá)水平與16例晚期大腸癌患者總生存時間及至腫瘤進(jìn)展時間的關(guān)系 總生存時間：ERCCmRNA低表達(dá)患者（41.1月）長于高表達(dá)患者（20.7月，P＝0.018）；患者至腫瘤進(jìn)展時間：ERCCmRNA高表達(dá)患者（9.5月）長于低表達(dá)患者（8.9月，P＝0.966）。

2.7 ERCC 與 BRCA－1表達(dá)具有正相關(guān)性（r＝0.497 P＜0.05）。

3 討論

鉑類藥物是治療大腸癌的有效藥物之一，但不同患者對治療的敏感性存在顯著差異，預(yù)后也不同。其作用機(jī)制主要通過和細(xì)胞DNA雙鏈耦合形成加合物或形成鏈間交叉連接而損傷DNA，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡，殺滅腫瘤細(xì)胞。DNA修復(fù)能力是影響鉑類藥物療效的重要原因，ERCC1－1是核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）途徑的限速酶，在NER途徑中起著DNA損傷識別和鏈間切割的關(guān)鍵作用，它的表達(dá)降低一方面預(yù)示腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加，腫瘤細(xì)胞惡性程度高，易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移［6］，但我們的研究顯示ERCC－1的表達(dá)與大腸癌分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目等惡性生物學(xué)行為無關(guān)（P＞0.05），提示ERCC－1盡管參與了腫瘤的惡性生物學(xué)行為，但由于大腸癌發(fā)生發(fā)展的不同階段是多基因參與、多因素共同作用的結(jié)果，因此并未對腫瘤細(xì)胞的惡性表型起決定性作用。另一方面ERCC－1表達(dá)降低提示腫瘤細(xì)胞對DNA靶向性藥物的修復(fù)能力降低，進(jìn)而增加藥物敏感程度，更易從此類藥物治療中獲益［7］。研究表明ERCC－1高表達(dá)能使順鉑誘導(dǎo)DNA結(jié)合物的清除率增加，從而降低順鉑的療效以及肺癌患者的生存時間。ERCC1表達(dá)與肺癌含鉑方案化療生存時間的關(guān)系經(jīng)國際多中心研究證實有肯定價值［8］：只有ERCC1低表達(dá)者可從化療中獲益，高表達(dá)不會獲得臨床療效，卻增加藥物毒副作用。Shirota Y［9］研究50例大腸癌腫瘤組織ERCC1，ERCC1低于臨界值，其 MST為10.2月，高于臨界值，其MST為1.9月，我們的研究也提示ERCC－1低表達(dá)患者在接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療后，晚期患者的總生存時間及所有期別患者的總生存期均長于高表達(dá)患者，提示ERCC－1不但是鉑類藥物的分子預(yù)測指標(biāo)，其低表達(dá)不管在早期還是晚期患者中均為預(yù)后良好的預(yù)測因素，多因素分析亦顯示ERCCmRNA低表達(dá)可以作為大腸癌患者預(yù)后良好的獨立預(yù)測因素，這與國外研究結(jié)論基本一致。

表1 54例大腸癌患者的臨床資料

表2 BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)與大腸癌患者OS的關(guān)系

表3 BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)與16例晚期大腸癌患者OS、TTP的關(guān)系

圖 A the OS of BRCA－1low－expression and high－expression（1.00 low－expression；2.00high－expression）圖B the OS of ERCC low－expression and high－expression（1.00lowexpression；2.00high－expression）

BRCA－1的重要功能是G2－M檢測點的調(diào)節(jié)，BRCA在有絲分裂期間聯(lián)合定位于中心體，控制有絲分裂紡錘體的組裝及子代細(xì)胞特有的染色體分離，從而影響細(xì)胞的分化。相關(guān)的研究表明，BRCA－1高表達(dá)預(yù)示著腫瘤惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，在乳腺癌及肺癌中已有報道［10，11］，但我們的研究提示BRCA－1mRNA的表達(dá)與腫瘤分期、及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為有顯著相關(guān)性（P＜0.05），但與腫瘤的分化程度及病理類型無關(guān)，說明BRCA可能通過基因調(diào)控多途徑參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但不參與腫瘤分化過程的調(diào)節(jié)。同時BRCA直接參與DNA的修復(fù)，BRCA－1編碼對DNA損害起反應(yīng)的蛋白，這些蛋白產(chǎn)物與Rad51及其它已知參與DNA修復(fù)的蛋白之間均有作用，BRCA的功能失活導(dǎo)致DNA斷裂的修復(fù)功能降低，從而使患者對DNA交聯(lián)劑、誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的藥物如鉑類敏感［7］。Rosell［12］等報道在接受以鉑類為基礎(chǔ)化療方案的非小細(xì)胞肺癌患者中，BRCA－1低表達(dá)的2年生存率高于BRCA－1高表達(dá)者，可見BRCA－1低表達(dá)患者能從鉑類藥物的治療中獲益。我們的結(jié)果顯示BRCA－1低表達(dá)患者在接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療后，低表達(dá)患者總生存期長于高表達(dá)患者，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。我們的研究顯示在晚期大腸癌患者中，其高表達(dá)患者總生存時間及至疾病進(jìn)展時間均長于低表達(dá)患者（P＜0.05），分析結(jié)果考慮與BRCA－1表達(dá)與患者分期有顯著相關(guān)性有關(guān)，在我們研究的16例晚期大腸癌患者中，有14例患者高表達(dá)，因此可能造成數(shù)據(jù)的偏倚性。因此也提示盡管其表達(dá)水平與ERCC表達(dá)存在正相關(guān)性，但BRCA可能在不同分期中有不同的預(yù)測意義，目前BRCA－1尚不能作為大腸癌患者鉑類藥物化療療效及預(yù)后的分子預(yù)測指標(biāo)。

總之，我們采用實時熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測大腸癌患者BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示ERCCmRNA表達(dá)水平可以作為預(yù)測大腸癌患者鉑類化療及預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)，而BRCA－1mRNA盡管與ERCCmRNA表達(dá)有正相關(guān)性，但其表達(dá)在不同期別患者中存在相反的結(jié)果，因此目前尚沒有足夠證據(jù)作為大腸癌患者預(yù)后及鉑類化療的預(yù)測因素，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

［1］Ross JS，Sc henkein D P，K ashala O，et al.Pharmacogenomics［J］.Adv Anat Pathol，2004，11：211.

［2］D J Gallagher，JA Konner，KM.Bell－McGuinn.Survival in epithelial ovarian cancer：a multivariate analysis incorporating BRCA mutation status andplatinum sensitivity［J］.Annals of Oncology，2011，22：1127.

［3］Lifeng Wang，Jia Wei，Xiaoping Qian，et al.ERCC1and BRCA1 mRNA expression levels in metastatic malignant effusions is associated with chemosensitivity to cisplatin and／or docetaxel［J］.BMC Cancer，2008，8：97.

［4］Lainie PM，Thomas CH，Russell JS，et al.The Role of DNA Repair Pathways［J］.Clin Cancer Res，2008，14：1291.

［5］M Joerger，D deJong，A Buryl，et al.BRCA1，ERCC1，Abraxas，RAP80mRNA expression，p53／p21immunohistochemistry and clinical outcome in patients with advanced non small－cell lung cancer receiving first－line platinum－gemcitabine chemotherapy［J］.Lung Cancer，2011，5：310.

［6］Zhu XD，Niedernhofer L，Kuster B，et al.ERCCl／XPF removes the 3’overhang fromuncapped telomeres and represses formationof telomeric DNA－containing doubleminute chromosomes［J］.Mol Ceil，2003，12：1489.

［7］McHugh PJ，Spanswick VJ，Hartley JA.Repair of DNA interstrand crosslinks：molecular mechanisms and clinical relevance［J］.Lancet Oncol，2001，2：483.

［8］Olaussen KA，Dunduant A，F(xiàn)ouret P，et al.DNA repairby ERCC1in non－small－cell lung cancer and cisplatin－based adjuvant chemotherapy［J］.N Engl J Med，2006，355（10）：983.

［9］Shirota Y，Stoehlmacher J，Brabender J，et al.ERCC1and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy［J］.J Clin Oncol，2001，19（23）：4298.

［10］Turner N，Tutt A，Ashworth A.Hallmarks of“BRCAness”in sporadic cancers［J］.Nat Rev Cancer，2004，4：814.

［11］Seung Jin Kim，Yasuo Miyoshi，Tetsuya Taguchi，et al.High Thioredoxin Expression Is Associated with Resistance to Docetaxel in Primary Breast Cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11：8425.

［12］Rosell R，Perez－Roca L，Sanchez JJ，et al.Customized treatment in non－samall－cell lung cancer based on EGFR mutation and BRCA－1mRNA expression［J］.PLos one，2009，4（5）：e5133.