羊睪丸原代細(xì)胞傳代試驗(yàn)

張玉紅，何玉仙，井蓮娜，王玉紅

（新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊830011）

羊睪丸原代細(xì)胞傳代試驗(yàn)

張玉紅，何玉仙，井蓮娜，王玉紅

（新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊830011）

生產(chǎn)山羊痘活疫苗時(shí)，羊睪丸采集工作量大，易污染，費(fèi)時(shí)費(fèi)事，是否有辦法減少人員外出采集羊睪丸次數(shù)，值得摸索，本實(shí)驗(yàn)將長(zhǎng)成單層的羊睪丸細(xì)胞進(jìn)行傳代，長(zhǎng)成致密單層后進(jìn)行接毒，收獲毒液，并對(duì)毒液及疫苗成品進(jìn)行病毒含量測(cè)定，結(jié)果表明，羊睪丸細(xì)胞完全可以傳一代，細(xì)胞形態(tài)良好，毒液、疫苗成品毒價(jià)均達(dá)到規(guī)程要求，羊睪丸原代細(xì)胞傳代可以大大提高睪丸組織利用率，降低人員勞動(dòng)強(qiáng)度。

羊痘疫苗；原代細(xì)胞；傳代

羊痘(Capripox)又名羊“天花”,是由山羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CPV)的痘病毒引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,主要表現(xiàn)為發(fā)熱，無(wú)毛或少毛部位的皮膚或黏膜發(fā)生丘疹和皰疹。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為A類(lèi)疾病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。此外，還有人類(lèi)感染羊痘的報(bào)道，世界各國(guó)都重視本病[2]。皮膚是病毒復(fù)制的主要場(chǎng)所[3]。本病只有羊感染發(fā)病，根據(jù)臨床癥狀，結(jié)合其流行病學(xué)特征，就可以做出初步診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷方法有多種，如病毒培養(yǎng)分離法、病毒中和試驗(yàn)(VN)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)、對(duì)流免疫電泳(CIEP)乳膠凝集試驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)、Western印跡實(shí)驗(yàn)、熒光抗體實(shí)驗(yàn)和間接熒光抗體試驗(yàn)等[4]。

1 材料與方法

1.1 羊睪丸細(xì)胞傳代試驗(yàn)

1.1.1 羊睪丸組織

烏魯木齊市郊區(qū)個(gè)體養(yǎng)殖戶處采集4月齡以?xún)?nèi)的健康雄性綿羊羔羊睪丸。

1.1.2 健康細(xì)胞

由本公司羊痘生產(chǎn)組提供生長(zhǎng)良好的健康的羊睪丸原代細(xì)胞。

1.1.3 種毒

山羊痘睪丸細(xì)胞培養(yǎng)弱毒株STV42，1983年9月16日凍干，各項(xiàng)指標(biāo)符合獸用生物制品制造規(guī)程[5]要求，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供，由本廠羊痘生產(chǎn)組連續(xù)傳代2次進(jìn)行種毒適應(yīng)和復(fù)壯，隨后直接通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，按照含1%～2%的毒種的細(xì)胞維持液生產(chǎn)的毒液用作種毒，凍干保存。按規(guī)程檢驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)符合規(guī)程中種毒要求。

1.1.4 儀器與設(shè)備

冰箱（海爾公司BCD216TDZA）、倒置顯微鏡（PULL公司生產(chǎn)的BDS-300）、計(jì)數(shù)板、水浴箱、15 000 mL血清瓶等均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.5 方法

將生長(zhǎng)良好的健康綿羊羔睪丸原代細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液，加入原生長(zhǎng)液量1/10的預(yù)熱的0.25%胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞層呈雪花狀時(shí)，倒去胰酶，先用少許生長(zhǎng)液搖下細(xì)胞，然后按1∶2的分種率，補(bǔ)足生長(zhǎng)液，混勻、分裝，37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接入含有1%～2%種毒的乳漢液，觀察細(xì)胞病變（CPE）達(dá)75%時(shí)凍結(jié)，再融化刮一次，共凍融兩次，每次一個(gè)大轉(zhuǎn)消化后分瓶的兩個(gè)大轉(zhuǎn)收的毒液混為一組，分別依上述方式重復(fù)6次試驗(yàn)。

1.2 羊睪丸原代細(xì)胞制備試驗(yàn)

按獸用生物制品制造規(guī)程要求選用四月齡以?xún)?nèi)的健康雄性綿羊，無(wú)菌摘取睪丸，剝棄白膜鞘膜，稱(chēng)取12 g睪丸組織，剪碎、漂洗、消化、分散，收集乳漢液定量1 500 mL細(xì)胞液分裝于一個(gè)大轉(zhuǎn)，細(xì)胞充分搖勻，于37℃溫室旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。，觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接入含有1%～2%種毒的乳漢液，觀察細(xì)胞病變（CPE）達(dá)75%時(shí)凍結(jié)，再融化刮一次，共凍融兩次，每次一個(gè)大轉(zhuǎn)為一組，分別依上述方式重復(fù)6次試驗(yàn)。

1.3 毒液半成品、成品的病毒含量（TCID50）的測(cè)定

將上述2組病毒液的樣品進(jìn)行無(wú)檢并用細(xì)胞測(cè)毒法檢測(cè)病毒含量（TCID50/mL）。將上述2組病毒液制成的成品樣進(jìn)行無(wú)檢并測(cè)定疫苗中的病毒含量（TCID50/頭份）。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞傳代一代后試驗(yàn)結(jié)果

原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較,可以看出原代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代一代的細(xì)胞長(zhǎng)成單層所用的時(shí)間在四天左右,與原代細(xì)胞長(zhǎng)成單層的時(shí)間差別不明顯，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 傳代一代的細(xì)胞與原代細(xì)胞長(zhǎng)成單層所用的時(shí)間對(duì)比情況

2.2 傳代一代的病毒液半成品的病毒含量測(cè)定

原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較,傳代細(xì)胞獲得的病毒液半成品病毒含量TCID50=106.1,符合規(guī)程要求的半成品TCID50》5.5要求,與原代細(xì)胞半成品毒價(jià)檢測(cè)結(jié)果差別不明顯,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞半成品及成品病毒含量測(cè)定對(duì)比情況

2.3 傳一代獲得的成品疫苗的效力檢驗(yàn)

效力檢驗(yàn)用羊檢驗(yàn)，將成品疫苗用生理鹽水稀釋成0.5 mL含0.01個(gè)使用劑量，胸腹部皮內(nèi)注射山羊3只，每只2顆，每顆0.5 mL，觀察15 d。在接種后5～7 d應(yīng)至少有2只山羊出現(xiàn)直徑為0.5～3 cm微紫紅色或無(wú)色痘腫反應(yīng)，且持續(xù)4 d以上，逐漸消退。發(fā)痘羊間或可有輕度體溫反應(yīng)，但精神食欲正常。試驗(yàn)發(fā)痘情況見(jiàn)表3。其它體征均正常,結(jié)果表明原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞效檢均達(dá)到規(guī)程要求。

表3 傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞成品效力檢驗(yàn)對(duì)比情況

3 討論

從羊睪丸原代細(xì)胞傳代一代結(jié)果可以看出，傳代一代細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞傳代一代的半成品、成品毒價(jià)均達(dá)到規(guī)程要求，說(shuō)明羊睪丸原代細(xì)胞進(jìn)行傳代完全是可行的。目前僅傳了一代。

由表4可以看出，同樣制備3 000 mL毒液，原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層的時(shí)間差別不大，因此傳代與不傳代的生產(chǎn)周期基本一樣，進(jìn)行傳代可以減少一倍人員外出采集睪丸的次數(shù)，大大降低人員勞動(dòng)強(qiáng)度，進(jìn)行傳代可以減少一半的睪丸用量，提高了睪丸組織的利用率，從表4可見(jiàn)，原代細(xì)胞的成本低于傳代細(xì)胞，但原代細(xì)胞人員比傳代細(xì)胞要多一倍，加上人員的費(fèi)用二者成本差異不顯著。選擇何種方式進(jìn)行生產(chǎn)完全在于生產(chǎn)者本身的出發(fā)點(diǎn)。

表4 原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞經(jīng)濟(jì)效益對(duì)比

本實(shí)驗(yàn)僅僅將羊睪丸原代細(xì)胞傳了一代，是否能繼續(xù)往下傳，能傳幾代，傳代后的細(xì)胞形態(tài)如何，而且傳代后的半成品、成品毒價(jià)如何，都有待于進(jìn)一步去跟進(jìn)。

羊睪丸原代細(xì)胞傳代一代的成功也為其它原代細(xì)胞如豬瘟細(xì)胞苗的傳代奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]CRAN V M.Control of capripoxvirus infection[J].Vaccine,1993,11(3):1275-1279.

[2]洪艷，謝忠文，施恒豫.人感染山羊痘5例[J].中華傳染病雜志,2005,23(2):143.

[3]BOWDEN TR BABIUK S L PARKYN G R et a.l Capripoxvirus tissue tropism and shedding:A quantitative study in experimentally infected sheep and goats[J].Virology,2008,371(2):380-393.

[4]徐維加，等.羊痘診斷與預(yù)防的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技2007，（3）：4-5.

[5]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸醫(yī)生物制品規(guī)程(2000年)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2000:142.

Subculture of Sheep Testicular Primary Cells

ZHANG Yu-hong，HE Yu-xian,JIN Lian-na,WANG Yu-hong
（Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830011，China）

when we produce goat pox vaccine,sheep testicles acquisition is a heavy job which was easily contaminated,time-consuming and cumbersome.Whether there are some ways to reduce our staff go out to collect sheep testicles,is worth fumble.In this experiment,a monolayer of sheep testicular cells were passaged so as to grow into a dense monolayer after inoculation,and to harvest venom,and measured the dose of virus. The results show that sheep testicular cells completely could subculture to one generation,and the cell morphology is satisfied to do next experiment,the venom and the final vaccine titer reached our requirements. Culture of generated cells can greatly improve working efficiency,and could reduce labor intensity.

goat pox vaccine;primary cells

S852.5

A

1003－6377（2013）03－0057-03

2013-02-11

張玉紅（1971-），女，獸醫(yī)師，主要從事疫苗生產(chǎn)工作。