有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查核磁共振定量分析儀器參數(shù)的研究＊

韋英亮，潘艷坤，楊益林

(廣西分析測試研究中心，南寧 530022)

有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查核磁共振定量分析儀器參數(shù)的研究＊

韋英亮，潘艷坤，楊益林

(廣西分析測試研究中心，南寧 530022)

以磺胺對甲氧嘧啶為例，對有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查核磁共振定量分析方法的儀器參數(shù)作了研究，主要包括脈沖寬度、弛豫延遲時間、掃描次數(shù)、譜寬、發(fā)射機(jī)頻率偏移、時域數(shù)據(jù)長度。分別對磺胺、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺苯吡唑7種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行期間核查含量測定，測定結(jié)果的相對誤差為0.1%～0.3%,準(zhǔn)確度與高壓液相色譜方法相當(dāng)。

有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；期間核查；核磁共振定量分析；磺胺對甲氧嘧啶；磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)光譜發(fā)現(xiàn)于1945年，雖然上世紀(jì)70年代就有人提出核磁共振譜可用于定量分析，但由于儀器靈敏度低，重現(xiàn)性差，測定所需樣品量大，不能滿足定量分析的要求，長期以來核磁共振波譜儀只是作為結(jié)構(gòu)測定的工具。而超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀的出現(xiàn)使得儀器性能大為改善，定量分析的精密度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度達(dá)到或接近了高效液相色譜儀的水平［1］。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在時間上具有保存量值、在空間上具有量值溯源的功能。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查是驗證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否處于校準(zhǔn)狀態(tài)，以確保分析結(jié)果的質(zhì)量［2］。因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查必須同時考察定性和定量兩方面。

目前有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查溯源性定值方法多為氣相色譜法和液相色譜法［3］，兩者均需重新購買新的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或者用一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)，有時還必須進(jìn)行工作曲線校準(zhǔn)才可以得到比較可信的結(jié)果。測試過程中儀器精密度受溫度、壓力、流動相等因素影響大，若要確保保留時間和峰面積的較好穩(wěn)定性就需要較長的儀器平衡時間。有的前處理需要衍生化等步驟，測試過程較為復(fù)雜耗時。核磁共振定性鑒定和定量分析可同步完成，定性鑒定無須標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于定性和定量時氫譜1H NMR的檢測時間短，重復(fù)性好，無須對樣品和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行特別的前處理，只要溶于合適的氘代試劑即可測定。核磁共振波譜定量分析在我國已見諸報道［4-8］，有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度滿足核磁共振定量檢測要求，而核磁共振定量分析用于有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查溯源性定值的報道尚不多見。筆者選用磺胺對甲氧嘧啶作為定量分析研究的對象，以對硝基甲苯作為內(nèi)標(biāo)物，共含有4種不同弛豫機(jī)理的質(zhì)子基團(tuán)：甲基、芳?xì)?、仲胺、叔胺。主要研究脈沖序列參數(shù)（脈沖寬度、延遲時間、掃描次數(shù)）及采樣參數(shù)（發(fā)射機(jī)頻率偏移、采樣點數(shù)）等因素對上述質(zhì)子峰面積的影響，探索最佳的定量分析儀器條件。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

核磁共振波譜儀：Bruker AvanceⅢ600型，5 mm BBO(寬帶觀測)探頭，1H的觀察頻率為600.17 MHz；

分析電子天平：Shimadzu AUW220D型，感量為0.01 mg，日本島津公司；

氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)：純度為99.9%，上海譜振生物科技有限公司；

磺胺對甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度為99.4%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

對硝基甲苯標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度為99.5%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品和內(nèi)標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取磺胺對甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)樣品135.40 mg，置于5 mL容量瓶中，用氘代二甲基亞砜溶解并定容至標(biāo)線，制成27.08 mg/mL磺胺對甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液。

取內(nèi)標(biāo)物對硝基甲苯56.77 mg，置于2 mL容量瓶中，同上法制成28.38 mg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 計算公式

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)X的計算公式如下：

式中：AS——被測樣品選定的積分面積；

ns——樣品被積分信號包含的質(zhì)子數(shù)；

Ms——被測樣品的相對分子質(zhì)量；

mR——稱取的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量；

wR——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

AR——內(nèi)標(biāo)物選定信號的積分面積；

nR——內(nèi)標(biāo)物被積分信號包含的質(zhì)子數(shù)；

MR——內(nèi)標(biāo)物的相對分子質(zhì)量；

ms——稱取的樣品質(zhì)量。

1.4 儀器調(diào)節(jié)

將試樣放入核磁共振譜儀中，調(diào)諧、勻場，然后測試氫譜，經(jīng)過傅里葉變換，對所得的譜圖進(jìn)行相位校正、基線校正，確定結(jié)構(gòu)正確無誤后，分別對定量峰和內(nèi)標(biāo)峰進(jìn)行積分。每個樣品重復(fù)測定5次。

2 儀器參數(shù)條件的選擇

2.1 脈沖寬度P1

實驗參數(shù)設(shè)置如下：弛豫延遲時間D1=10 s；掃面次數(shù)為NS=8次；譜寬SW=15.019 7×10-6；發(fā)射機(jī)頻率偏移為8.260×10-6；采樣溫度T=298.0 K；時域數(shù)據(jù)長度TD=64 K 。

樣品：27.08 mg/mL磺胺對甲氧嘧啶（溶劑為DMSO-d6）。

信號積分處理：設(shè)磺胺對甲氧嘧啶芳環(huán)2位質(zhì)子δ 7.60（2H，d，J=8.76 Hz）的積分面積為2.000 0，積分范圍為δ 7.64～7.56；3位質(zhì)子δ 6.57（2H，d，J=8.76 Hz）的積分范圍為δ 7.60～7.52；3’位質(zhì)子δ 8.26（2H，s）的積分范圍為δ 8.30～8.22；伯胺根質(zhì)子（—NH2） δ 5.96（2H，s）的積分范圍為δ 5.99～5.91；仲胺根質(zhì)子（—NH—） δ 10.99（1H，s）的積分范圍為δ 11.02～10.94；甲氧基質(zhì)子（—OCH3） δ 3.78（3H，s）的積分范圍為δ 3.81～3.73。

脈沖的作用是建立橫向磁化強(qiáng)度，1H NMR定量實驗首先要求儀器的90°脈沖寬度必須準(zhǔn)確，按照儀器脈沖校正的要求，采用0.1%乙基苯（溶劑為氘代氯仿）重新校正儀器氫譜的90°脈沖寬度，得到儀器90°脈沖寬度為14.25 μs。圖1、圖2為所測定磺胺對甲氧嘧啶及內(nèi)標(biāo)對硝基甲苯的核磁共振氫譜。

圖1 磺胺對甲氧嘧啶的結(jié)構(gòu)及其氫譜

圖2 對硝基甲苯的結(jié)構(gòu)及其氫譜

從P1=1.00 μs開始，逐漸增加脈沖寬度，測得質(zhì)子峰相對峰面積見表1。

由表1可見，隨著P1的增加，芳香質(zhì)子積分面積下降，活潑氫變化趨勢不明顯，甲基變化不大。當(dāng)脈沖寬度小于5 μs時，只有芳香質(zhì)子積分面積接近實際值2，甲基、活潑氫—NH2和—NH—都達(dá)不到實際值3，2和1。因為采用90°脈沖激發(fā)NMR樣品以獲取最強(qiáng)的發(fā)射信號，脈沖寬度增大后，需要增大激發(fā)脈沖之間的間隔時間使樣品充分弛豫。如果需要重復(fù)激發(fā)樣品，更有效的方法是使用30°脈沖激發(fā)，減少相應(yīng)的弛豫時間。雖然每個放射信號比較弱，但更快的數(shù)據(jù)累加速度使30°脈沖在整體上擁有更好的靈敏度，所以脈沖寬度以不超過30°為宜。因此當(dāng)儀器的90°脈沖寬度為14.25 μs時，其30°脈沖寬度應(yīng)該是14.25 μs的三分之一，即為4.75 μs。與實際測定值小于5 μs一致。所以應(yīng)該選擇脈沖程序“zg30”，其唯一脈沖寬度是P1，即4.75 μs 。

表1 脈沖寬度P1對相對峰面積積分的影響

實驗選擇磺胺對甲氧嘧啶2位質(zhì)子δ 7.60（2H，d，J=8.76 Hz）作為定量峰，積分范圍為δ 7.64～7.56；內(nèi)標(biāo)峰取對硝基甲苯中的δ 7.46（2H，d，J=8.40 Hz），積分范圍為δ 7.50～7.42。

2.2 弛豫延遲時間D1

弛豫延遲時間D1對各質(zhì)子峰相對峰面積影響的實驗數(shù)據(jù)見表2。實驗參數(shù)除延遲時間D1和P1=4.75 μs外，其它參數(shù)同2.1。

表2 延遲時間D1對各質(zhì)子峰相對面積的影響

脈沖前延遲時間D1是為了保證實驗之前系統(tǒng)有足夠的宏觀（縱向）磁化強(qiáng)度。一系列的脈沖和不足的弛豫時間激發(fā)NMR 樣品會造成樣品飽和。為了使樣品釋放出更多的能量，每個脈沖前都添加了“D1”延遲。這樣可以使樣品有足夠的時間來弛豫。當(dāng)選擇脈沖程序“zg30”時，D1是唯一的延遲。由表2數(shù)據(jù)可以看出，不同環(huán)境的芳香質(zhì)子隨著延遲時間D1的增大相對峰面積有不同的變化趨勢，但都是在延遲時間D1=10.00 s左右趨近實際值2 ，同時甲基也在在延遲時間D1=10.00 s左右趨近實際值3。而隨著延遲時間D1的增大活潑氫相對峰面積有變小的趨勢。因此可以確定實驗的延遲時間D1=10.00 s。

2.3 掃描次數(shù)NS

實驗了掃描次數(shù)NS對各質(zhì)子峰相對面積的影響，結(jié)果見表3。實驗參數(shù)除NS外，其它參數(shù)同2.1。

表3 掃描次數(shù)NS對各質(zhì)子峰相對面積的影響

在NMR實驗中，經(jīng)常需要多次掃描來改善譜圖質(zhì)量，實驗時間也相應(yīng)增加。從表3中數(shù)據(jù)可以看出，對活潑氫和甲基質(zhì)子來說，無論掃描次數(shù)多少，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性都很差。掃描次數(shù)小于64次時，苯環(huán)質(zhì)子的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性也很差.只有當(dāng)掃描次數(shù)不小于64次時，質(zhì)子才趨近實際質(zhì)子總數(shù)2，數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。可以確定掃描次數(shù)為64次即可滿足一般分析的要求。這樣處理是為了節(jié)省實驗時間，提高分析效率。

2.4 發(fā)射機(jī)頻率偏移

實驗了發(fā)射機(jī)頻率偏移對質(zhì)子峰相對峰面積的影響，結(jié)果見表4。實驗參數(shù)除脈沖寬度P1=4.75 μs，NS=64和發(fā)射機(jī)頻率偏移外，其它參數(shù)同2.1。

之前設(shè)定的譜寬SW=15 ×10-6，從譜圖上找到所有質(zhì)子對應(yīng)的信號。發(fā)射機(jī)頻率偏移的確定是為了重新定義譜寬，在保證信號不丟失的情況下得到分辨率更高的譜圖。從低場到高場，將發(fā)射機(jī)頻率偏移分別設(shè)在每一個峰的中心位置上。表4數(shù)據(jù)顯示，發(fā)射機(jī)頻率偏移無論設(shè)在哪個點位上，苯環(huán)質(zhì)子都接近實際值2，活潑氫質(zhì)子—NH2和—NH—都分別小于2和1，甲基質(zhì)子都大于3。為了得到分辨率較高的譜圖，譜寬SW=15×10-6顯然不合適，有必要減小譜寬，將譜寬設(shè)置為SW=13×10-6，發(fā)射機(jī)頻率偏移設(shè)為5.96是合理的。

表4 發(fā)射機(jī)頻率偏移對各質(zhì)子峰相對面積的影響

2.5 其它參數(shù)

時域數(shù)據(jù)長度(Time Domain Data Size，TD)的值就是從FID中采樣和數(shù)字化的點數(shù)(side of fid)。增大FID會改善FID 分辨率，同時也會需要更長的采樣時間，但對峰面積影響不大，對1D FID，TD一般為16，32 或者64 K。對于定量實驗取64 K。采樣時間Acquisition Time(AQ)，是完成一次掃描所需要的時間（單位為秒），根據(jù)TD 和SW計算得出。也可以直接修改AQ值，這時TD 的值會相應(yīng)改變?？偟膩碚f，采樣時間對質(zhì)子峰相對峰積分面積沒有明顯影響。

3 結(jié)果與討論

綜合上述儀器條件，實驗參數(shù)設(shè)置如下：90°脈沖寬度：14.25 μs；脈沖程序：zg30；脈沖延遲時間（D1）：10.00 s；掃描次數(shù)（NS）：64次；譜寬（SW）：13 ×10-6；發(fā)射機(jī)頻率偏移：5.69 ×10-6；時域數(shù)據(jù)長度（TD）：64 K；采樣溫度（T）：298 K。取磺胺對甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液300.0 μL 和對硝基甲苯內(nèi)標(biāo)溶液300.0 μL，置于核磁管中，平行制備7份樣品，測定磺胺對甲氧嘧相對含量，考察重復(fù)性結(jié)果見表5。由表5可知，方法的重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果 %

選擇磺胺、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺苯吡唑7種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按上述儀器參數(shù)條件對每個樣品的積分值測定3次，取其平均值，并與高壓液相色譜檢測結(jié)果比較，結(jié)果見表6。由表6可知，核磁共振法測定結(jié)果與高壓液相色譜法的測定結(jié)果相近，相對誤差均在0.1%～0.3%之間，滿足磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查定值方法的要求。

表6 磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查含量測定結(jié)果 %

綜上所述，核磁共振定量分析應(yīng)注意以下條件：

（1）確定準(zhǔn)確的90°脈沖寬度，脈沖程序選擇30°小角度脈沖；

（2）要有足夠的弛豫延遲時間，保證實驗之前系統(tǒng)有足夠的宏觀磁化強(qiáng)度；

（3）要有足夠的掃描時間，保證譜圖質(zhì)量和各個質(zhì)子積分面積的穩(wěn)定性；

（4）設(shè)置合適的譜寬和發(fā)射機(jī)頻率偏移，確保譜圖有良好的分辨率；

（5）選擇合理的定量峰和內(nèi)標(biāo)峰，甲基和活潑氫不適合作為定量峰；

（6）定量分析時，要認(rèn)真勻場，磁場均勻才能保證譜儀的分辨率；相位校正可確保峰形左、右對稱，呈正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)吸收峰形，為了避免出現(xiàn)邊帶應(yīng)盡量不旋轉(zhuǎn)樣品；校正基線使所有質(zhì)子的化學(xué)位移成水平直線；統(tǒng)一選用溶劑峰定標(biāo)；先將譜圖放大，取峰形輪廓線與完全水平的基線剛好重合處作為定量峰和內(nèi)標(biāo)峰的積分區(qū)域，這樣才能夠保證積分面積重現(xiàn)性良好。

4 結(jié)論

磺胺類有機(jī)物的基本結(jié)構(gòu)為對氨基苯磺酰胺，采用對硝基甲苯為內(nèi)標(biāo)物可以對所有的磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行含量測定。因此，核磁共振核波譜法定性無須標(biāo)準(zhǔn)品，利用譜圖化學(xué)位移、耦合常數(shù)、質(zhì)子數(shù)可以給物質(zhì)定性；只要選定一種合適的內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法，就可以對一系列結(jié)構(gòu)相似的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行含量測定，為實驗室節(jié)省大筆購買新標(biāo)樣的經(jīng)費(fèi)，節(jié)約實驗成本。且定量分析穩(wěn)定性好，只需測試一次就可以得到可靠的結(jié)果，分析效果與HPLC法相近。因此核磁共振波譜法可以作為實驗室有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)期間核查量值溯源性定值分析方法的輔助手段之一。

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Instrument Parameters of NMR for Quantitative Analysis of the Organic Standard Substances Period Verification

Wei Yingliang，Pan Yankun，Yang Yilin
(Guangxi Analytical Center，Nanning 530022，China)

Sulfameter as a sample, the instrument parameters of NMR including pulse width，delay time, number of scans, spectral width etc. for quantitative analysis to the organic standard substances period verification were discussed. The relative error of sulfanilamide, sulfameter, sulfamonomethoxine, sulfathiazloe, sulfadiazine, sulfapyridine and sulfaphenazolum reference materials determined by NMR were 0.1%-0.3%, which matched HPLC method in accuracy.

organic standard substance; period verification; NMR for quantitative analysis; sulfameter; sulfonamides reference Material

O657.61

A

1008-6145(2013)02-0070-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2013.02.020

*廣西壯族自治區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(No.2011AC202)

聯(lián)系人：韋英亮； E-mail: wyl3903895@163.com

2012-12-26