宋少云，廖 威，2，陳維春，3，李廣宏

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院//有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275;2.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)系，廣西南寧530226;3.廣東醫(yī)學(xué)院生化和分子生物研究所，廣東湛江524023)

蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)被廣泛應(yīng)用于防控鱗翅類昆蟲，但是溶原性噬菌體的隨機(jī)爆發(fā)對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑生產(chǎn)有很大的危害。蘇云金芽孢桿菌83%的亞種都是溶原性噬菌體的寄主［1－2］，噬菌體隨機(jī)爆發(fā)的幾率為15% ～30%，少數(shù)為50% ～80%，甚至可達(dá)100%［3］。由于噬菌體的隨機(jī)爆發(fā)造成殺蟲劑生產(chǎn)巨大損失，從1960年以來(lái)就開展了大量的研究［4］，但到目前為止，還沒(méi)獲得有效的方法來(lái)抑制噬菌體的隨機(jī)爆發(fā)。1984年，發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌菌種H14細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)小DNA分子的存在，它是一個(gè)能夠遷移的線性質(zhì)粒［5］;這個(gè)線性的DNA分子實(shí)際上對(duì)應(yīng)的是溶源性噬菌體的前噬菌體形式。

目前只有3個(gè)從蘇云金芽孢桿菌中分離的噬菌體 GIL01，Bam35和 GIL16，已進(jìn)行了 DNA測(cè)序［5－7］。GIL01和Bam35屬于復(fù)層噬菌體科，它們能夠侵染很多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在結(jié)構(gòu)上只有少數(shù)幾種核苷酸有差別。這3種噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)有著非常緊密的關(guān)聯(lián)性［5］，但對(duì)隨機(jī)爆發(fā)噬菌體的機(jī)理仍然知之甚少。

噬菌體MZTP02是從蘇云金芽孢桿菌菌株MZ1分離出來(lái)的［8］。它有一個(gè)20面體的頭部、一條長(zhǎng)的尾巴，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)尾刺。噬菌體基因組已經(jīng)測(cè)序，全長(zhǎng)15717 bp， (G+C)含量為37.55%(GenBank，Accession No.AY894696)。序列分析表明兩個(gè)40 bp長(zhǎng)度內(nèi)嵌終端的堿基重復(fù)率為65%，其功能為連結(jié)兩端的基因組。噬菌體MZTP02基因組為包含tmp基因在內(nèi)的20個(gè)開放讀碼框(ORFs)，其中有9個(gè)編碼噬菌體的尾巴蛋白質(zhì)，還有2個(gè)終端酶亞體、運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、頭部蛋白質(zhì)和尾巴組分等蛋白質(zhì)。

Tmp基因編碼的尾卷尺蛋白質(zhì) (TMP，tape measure protein)在噬菌體Bam35，Gil01，GIL16和MZTP02中也被發(fā)現(xiàn)［9］。TMP蛋白質(zhì)是一種組成噬菌體尾巴的組分，它在吸附時(shí)可以幫助噬菌體吸附細(xì)菌，并控制尾巴的長(zhǎng)度或者是尾巴蛋白亞體的形成，其功能類似于噬菌體的尾巴裝配蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可能包括了尾巴長(zhǎng)度控制蛋白質(zhì)，尾巴纖維蛋白質(zhì)，尾巴組分蛋白質(zhì)和尾巴亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。

本文從噬菌體MZTP02中克隆到tmp基因并在原核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。功能結(jié)構(gòu)分析表明TMP蛋白質(zhì)在寄主中可以結(jié)合抗血清蛋白和吸附點(diǎn)，這說(shuō)明TMP蛋白質(zhì)具有控制裝配噬菌體尾巴的功能。TMP抗血清可以抑制噬菌體的滴度，估計(jì)可用于解決蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)中控制噬菌體爆發(fā)的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 菌株與噬菌體

出發(fā)菌株MZ1(B.thuringiensis subsp.kurstaki，sv.H3a3b3c)分離自廣東省梅州市某公司。蘇云金芽孢桿菌 ZK1(B.thuringiensis subsp.coreanensis，sv.H25)、大腸桿菌 (E.coli)菌株TG1和M15為本實(shí)驗(yàn)室保藏。噬菌體MZTP02通過(guò)絲裂霉素C誘變菌株MZ1中分離得到。

1.2 噬菌體MZTP02的純化及其基因組DNA的提取

篩選指示劑菌株ZK1，噬菌體滴度的測(cè)定和雙層瓊脂平板的制作根據(jù)Yu and Si［10］的方法。溶源性噬菌體的檢測(cè)方法為:出發(fā)菌株MZ1培養(yǎng)過(guò)夜制得的菌懸液，用質(zhì)量濃度0.5 μg/mL的絲裂霉素C處理，震蕩4 h。然后，5 μL的誘導(dǎo)液、200 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的檢測(cè)菌株ZK1和3 mL含w=0.7%瓊脂的LB的培養(yǎng)基混合均勻后，倒入已經(jīng)凝結(jié)有底層培養(yǎng)基 (含w=2%瓊脂的LB培養(yǎng)基)的平皿里，制作雙層培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12～16 h。出現(xiàn)噬菌斑，證明原菌株有溶源性噬菌體存在。選取單獨(dú)的噬菌斑純化，純化根據(jù)Sambrook［11］的方法，連續(xù)純化5代。噬菌體基因組DNA的分離提取根據(jù) Verheust［7］的方法。

1.3 在E.coli M15菌株中表達(dá)tmp基因

雙引物，P1:5'-GGATCCATGGGAATAATCGGGGCTACTTGG-3'和P2:5'-GTCGACCTAAAATACTTTCAATCTTTCTTTC-3'，兩端含有BamHI與SalI限制酶位切點(diǎn)，使用PCR擴(kuò)增噬菌體tmp基因。PCR產(chǎn)物提純后，克隆到質(zhì)粒pMD18-T(TaKaRa)，然后轉(zhuǎn)入 pQE30(Qiagen)構(gòu)建pQE30tmp載體，其中TMP蛋白質(zhì)在N端與6×His融合。包含 pQE30tmp載體的 E.coli M15(pREP4)的菌體細(xì)胞培養(yǎng)至濁度0.6(A600nm)后，加入1 mmol/L isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)的誘變劑，于37℃保溫4 h。離心15 min，轉(zhuǎn)速7000 r/min。融合蛋白使用w=12% 的SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4 His-tagged TMP蛋白的純化及其抗體的制作

6×His-tagged蛋白質(zhì)的純化根據(jù)QIAexpressinistTM手冊(cè)中方法進(jìn)行。根據(jù) Andrews［12］的方法，純化的6×His-tagged蛋白質(zhì)用來(lái)采集兔子的抗體毒素血漿。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

SDS-PAGE:分離膠的w為12%，方法見文獻(xiàn)［11］。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜的方法見Hybond-C super，Amersham Pharmacia。w=1%封閉溶液進(jìn)行印跡封閉，TMP蛋白抗體和原血清濃度比例為1∶500。免疫反應(yīng)蛋白顯示使用羊抗兔IgG和堿性磷酸酶。

1.6 tmp基因的功能分析

噬菌體滴度的測(cè)定方法見 Yu and Si［10］。TMP抗體從注射TMP蛋白的兔子血液中采集。稀釋的TMP蛋白與噬菌體溶液混合，首先要試驗(yàn)出噬菌體滴度的范圍，使TMP蛋白與噬菌體的滴度存在一種正比關(guān)系。在此比例的范圍內(nèi)，噬菌體溶液分別與TMP抗體、對(duì)比蛋白質(zhì)和同源的胞壁酸酶混合。

2 結(jié)果

2.1 tmp基因的克隆

來(lái)自噬菌體MZTP02基因組DNA的tmp基因通過(guò)PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)了一條大小為1000的單一條帶 (圖1:A)。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T質(zhì)粒并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與MZTP02基因組中tmp基因的序列一致。BamHI/SalI限制酶分析顯示，基因片段已經(jīng)插入了質(zhì)粒pMD18-T中相應(yīng)的位點(diǎn)上 (圖1:B)。使用BamHI/SalI限制酶處理的基因片段與pQE30載體連接，重組載體命名為pQEtmp。經(jīng)BamHI/SalI限制酶分析，表明tmp基因被正確插入 (圖 1∶C)。

2.2 tmp基因在E.coli M15菌株中的表達(dá)及其純化

含有pQEtmp質(zhì)粒的E.coli M15菌株在37℃用IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)5 h，然后收獲細(xì)胞。從含有pQEtmp質(zhì)粒的E.coli M15菌株中獲得了一條35000的蛋白帶 (圖2)，此帶與預(yù)期的TMP蛋白質(zhì)大小相當(dāng)，對(duì)比蛋白中沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白帶。TMP蛋白表達(dá)融合了6×His，使用Ni-NTA柱子純化。所有的泳道中僅出現(xiàn)一條蛋白帶 (圖3)。

2.3 TMP抗血清蛋白的制備和檢測(cè)

TMP抗血清蛋白從兔子血液中采集，兔子注射純化并融了6×His的TMP蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡分析表明，抗體血清檢測(cè)出在E.coli菌株表達(dá)的融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生了一條清晰的蛋白帶，大小為35000，而非免疫血清沒(méi)有相應(yīng)的條帶 (圖4)。

2.4 tmp基因的功能分析

為了檢測(cè)噬菌體的滴度，將TMP抗血清與噬菌體懸液混合。結(jié)果表明，在噬菌體m.o.i滴度小于1時(shí)，噬菌體滴度與TMP抗血清的濃度成負(fù)比例關(guān)系。當(dāng)一個(gè)指定的噬菌體質(zhì)量濃度分別與25 μg/mL和250 μg/mL的TMP抗血清混合時(shí)，相應(yīng)地噬菌體的滴度分別為1×105pfu/mL和2×103pfu/mL;同時(shí)，采用高純度、來(lái)自相同基因組但不同基因的胞壁酸酶 (muramidase，MUR)作對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體的滴度為107pfu/mL(圖5)。當(dāng)加入噬菌體懸液的TMP蛋白抗體質(zhì)量濃度增加10倍時(shí)，噬菌體滴度卻降低了50倍。這意味著TMP蛋白質(zhì)可以與寄主細(xì)胞上的吸附點(diǎn)結(jié)合。在TMP蛋白質(zhì)存在的情況下，該蛋白與其抗體即吸附點(diǎn)相結(jié)合，因此降低了噬菌體的滴度。TMP蛋白質(zhì)可能是噬菌體尾巴的一部分，并控制噬菌體尾巴的裝配。但是實(shí)驗(yàn)表明，假如噬菌體m.o.i滴度大于1時(shí)，噬菌斑的形成與TMP抗血清沒(méi)有顯示出負(fù)效果。

3 討論

噬菌體 phi 11(NP_663684)，ul36(NP_663684)，λ Ba01(YP_020410)，r1t(NP_695070)，phi LC3(NP_996715)，TP901－1(NP_112708)，TM4(AAD17585)，phi 3626(NP_612842)和315.6(NP_795697)與噬菌體MZTP02的tmp基因序列有較高同源性，這些噬菌體中的tmp基因功能是控制噬菌體尾巴的形成、裝配及構(gòu)建整個(gè)噬菌體尾巴的部件，如尾絲和尾板［13－14］。從以上10種噬菌體tmp基因的保守區(qū)的類同來(lái)判斷，可以肯定的是噬菌體MZTP02與其他的噬菌體存在著某些相同的功能。

圖1 tmp基因的克隆和鑒定Fig.1 Cloning and identification of tmp geneA:tmp基因的PCR產(chǎn)物(lane 1);B:pMD18-Ttmp/BamHI+SalI的鑒定 (lane 1);C:pQEtmp(lane 1)和pQE30載體的鑒定 (lane 2);M:蛋白質(zhì)標(biāo)記

圖2 tmp基因表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expressed proteins from tmp geneLane 1－3分別為:M15(pQE30)，非誘導(dǎo)的M15(pQEtmp)和誘導(dǎo)的M15(pQEtmp);M:蛋白質(zhì)標(biāo)記

圖3 純TMP蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified TMP proteinLane 1－4:從緩沖液D中的抽提物;Lane 5－7:從緩沖液E中的抽提物;M:蛋白質(zhì)標(biāo)記

另外，tmp基因的蛋白質(zhì)序列與來(lái)自57種噬菌體的10種蛋白質(zhì)顯示出同源性［9］，特別同源于來(lái)自Staphylococcus aureus和Lactococus lactis細(xì)胞的噬菌體 λBa01，噬菌體 MZTP02與噬菌體 λBa01，rlt，phiL3，TP901－1和ul36同屬于一個(gè)進(jìn)化系中。但是噬菌體MZTP02與以上10種之外的噬菌體沒(méi)有太高的同源性。例如，與Staphylococcus aureus細(xì)胞的噬菌體phi 13僅有28%的同源性。

圖4 TMP蛋白質(zhì)的印跡分析試驗(yàn)Fig.4 Western blot analysis of TMP proteinsLane 1－2分別為:注射前兔血清和注射后血清;M:預(yù)染的蛋白質(zhì)標(biāo)記

圖5 噬菌體懸液與TMP抗血清形成噬菌斑的檢測(cè)Fig.5 Detection of plaque formation of phage treated with TMP antiserumA1和B1:無(wú)抗血清的對(duì)比平皿;A2:25 μg/mL TMP抗血清;B2:250 μg/mL TMP 抗血清;C1:250 μg/Ml TMP抗血清;C2:250 μg/mL MUR抗血清

tmp基因編碼控制噬菌體尾巴長(zhǎng)度及其他功能的蛋白質(zhì)［9］，所以該基因與噬菌體尾巴的裝配有關(guān)。編碼的蛋白質(zhì)可能包括尾巴長(zhǎng)度的控制蛋白、尾絲蛋白、尾巴構(gòu)件蛋白、尾巴亞結(jié)構(gòu)蛋白，等等。當(dāng)這些抗原蛋白質(zhì)與相應(yīng)的抗體結(jié)合時(shí)，它們對(duì)宿主的吸附被消弱了。TMP抗血清與宿主的吸附點(diǎn)共同競(jìng)爭(zhēng)噬菌體。TMP抗血清的質(zhì)量濃度越大，噬菌體能夠吸附宿主的幾率就越小，形式噬菌斑的數(shù)量就越少。因此，這一關(guān)系可以通過(guò)檢測(cè)噬菌斑點(diǎn)滴度的變化來(lái)分析tmp基因的功能。

推測(cè)噬菌體MZTP02是一個(gè)新品種，它從發(fā)酵菌株蘇云金芽孢桿菌 MZ1細(xì)胞中分離出來(lái)?；蚪M分析表明，tmp基因的位置在10828 bp和11872 bp之間，長(zhǎng)度1044 bp。它編碼了一個(gè)含有348個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，大小35500。tmp基因的功能使用TMP抗體來(lái)分析，抗體被加到具有一定濃度的噬菌體懸液中，噬菌斑的滴度下降50倍，這一現(xiàn)象說(shuō)明該基因的蛋白質(zhì)功能與噬菌體的尾巴裝配有關(guān)。其理由可能是，當(dāng)噬菌體與TMP抗血清混合時(shí)，抗體與噬菌體尾巴或者部分尾板結(jié)合，因此噬菌體尾巴難以、甚至無(wú)法與宿主細(xì)胞上的吸附點(diǎn)結(jié)合。這就解釋了tmp基因編碼類似于尾板、尾絲、結(jié)合蛋白等蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)具有與宿主吸附點(diǎn)結(jié)合的能力［15］。但發(fā)現(xiàn)當(dāng)噬菌體的滴度m.o.i大于1時(shí)，滴度并沒(méi)有反映這種負(fù)比例關(guān)系，說(shuō)明很多噬菌體顆粒在同一時(shí)間內(nèi)吸附到一個(gè)宿主細(xì)胞上，導(dǎo)致了該宿主細(xì)胞的破裂。

盡管我們推測(cè)到噬菌體尾巴與宿主細(xì)胞上的吸附點(diǎn)之間有這種關(guān)系，但還有不了解的地方，噬菌體尾巴是怎樣與吸附點(diǎn)結(jié)合的?屬于Lactococcuslactis家族的溶源性噬菌體TP901－1有一條很長(zhǎng)、不會(huì)收縮、有終端基板的尾巴，后者估計(jì)與宿主細(xì)胞吸附點(diǎn)相結(jié)合起主要作用，但是其結(jié)合的機(jī)理還不清楚［16－17］。

另外一個(gè)蛋白質(zhì)，捕獲結(jié)合蛋白質(zhì) (Capture binding protein，CBP)，可能涉及到噬菌體與宿主細(xì)胞的相互作用之中。這一蛋白與其他的蛋白質(zhì)有著很多類似性，但是這些蛋白質(zhì)的碳端結(jié)構(gòu)大多不同［18］。有兩種噬菌體蛋白質(zhì)，大小分別為31000和16000，涉及到噬菌體與宿主細(xì)胞的相互作用之中［19］。一些噬菌體DNA的序列被測(cè)出，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)讀碼框，該讀碼框部分折疊并與編碼必要的尾巴蛋白質(zhì)相結(jié)合［20］。當(dāng)噬菌體與宿主細(xì)胞吸附點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)，非收縮尾巴不會(huì)在吸附反應(yīng)中起到主要的作用［21］。

從早期的工作中了解到，噬菌體T4的基因29編碼尾巴蛋白的長(zhǎng)度［22］。對(duì)于具有收縮性或者是非收縮性尾巴的噬菌體，尾巴的長(zhǎng)度由tmp基因決定。對(duì)于大多數(shù)的噬菌體，相應(yīng)的蛋白質(zhì)則由其基因組中的開放讀碼框決定［23］。在下個(gè)試驗(yàn)中，將tmp基因敲除掉并觀察噬菌體突變體，以期發(fā)現(xiàn)噬菌體MZTP02基因組tmp基因更多的功能。

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