李曉鐘王曉霞安奇君馮建宏裴毅

1.山西省人民醫(yī)院急診科，山西 太原 030032；

2.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001；

3.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西大醫(yī)院老年腫瘤科，山西 太原 030032

RNA干擾STK15基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李曉鐘1王曉霞2安奇君1馮建宏1裴毅3

1.山西省人民醫(yī)院急診科，山西 太原 030032；

2.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001；

3.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西大醫(yī)院老年腫瘤科，山西 太原 030032

STK15；RNA干擾；結(jié)腸癌；凋亡

STK15(serine/threonine kinase15)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過磷酸化下游特定底物影響G2/M期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)中心體成熟、雙極紡錘體建立以及染色體的分離［1-2］。許多研究表明，多種腫瘤中STK15呈高表達(dá)狀態(tài),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［3-8］。而作為阻斷基因表達(dá)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)為腫瘤基因治療提供了新的策略和途徑［9］。因此，本研究通過將表達(dá)靶向STK15的短發(fā)夾狀雙鏈RNA(shRNA)表達(dá)質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，觀察其對(duì)STK15表達(dá)的抑制作用，并進(jìn)一步研究STK15基因沉默與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系，從而揭示利用RNA干擾技術(shù)沉默STK15基因的表達(dá)，將為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

pGPU6/GFP/Neo-STK15質(zhì)粒由本室構(gòu)建，人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞由本室保存，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，STK15抗體購(gòu)自Cell Signal公司，β-actin和Caspase-3抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，碘化丙啶(PI) 染色液、RNase A購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide，MTT］購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)，用無血清培養(yǎng)基洗3遍，將20 μL LipofectamineTM2000和10 μg pGPU6/GFP/Neo-STK15質(zhì)?；蚩蛰d體pGPU6/GFP/Neo分別稀釋于500 μL無血清培養(yǎng)基中，室溫溫育5 min。再將稀釋的脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA混合，室溫溫育20 min后將其加入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，補(bǔ)充無血清培養(yǎng)基至2 mL。6 h后補(bǔ)加含20%胎牛血清的培養(yǎng)基2 mL，24 h后換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。48 h后加入G418篩選，14 d后獲得STK15基因沉默的穩(wěn)定克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)

參照TRIzol說明書提取細(xì)胞總RNA。細(xì)胞中加入1 mL TRIzol，移至EP 管中，再加入0.2 mL氯仿，室溫下放置2～3 min后，12 000×g離心15 min，取上層水相置于新EP管中，加入0.5 mL異丙醇，室溫下放置10 min，12 000×g離心10 min。棄上清液，加1 mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌沉淀，10 000×g離心5 min，棄上清液。沉淀RNA自然干燥后用DEPC水溶解。以RNA為模板，Random 6 mers和Oligo dT 為引物，在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成cDNA。再以cDNA 為模板，dNTP為原料，在PCR緩沖液中經(jīng)Taq酶催化擴(kuò)增STK15 基因，上游引物為：5’-AATGATTGAAGGTCGGATGC-3’；下游引物為：5’-TTCTCTGAGCATTGGCCTCT-3’。以看家基因GAPDH 為內(nèi)參照，其引物為：上游： 5’-GCT GAG AACGGGAAGCTTGT-3’；下游：5’-GCCAGGGG TGCTAAGCAG TT-3’。引物由TAKARA公司合成。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共30 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)

細(xì)胞中加入蛋白裂解液(50 mmol/L Tris (pH為7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，1 μg/mL Aprotinin，1 μg/mL leupeptin，100 μg/mL PMSF)，冰上作用40 min，12 000×g，離心20 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。蛋白加熱變性后，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉2 h，加入兔抗人多克隆一抗STK15(1∶1 000)或Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃溫育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗(1∶2 000)，室溫下溫育1 h。ECL法檢測(cè)目的條帶。β-actin作為內(nèi)參。圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔3 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板上，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組6 孔，分別在第1、3、5、7、9天以MTT法檢測(cè)其吸光度(A)值。每孔中加入濃度為0.2 mg/mL的MTT液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)3 h，吸去上清液，加入DMSO 150 μL/孔，充分震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)比色測(cè)定每孔A值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集細(xì)胞，PBS洗3次，冷乙醇4℃固定過夜。上機(jī)前500×g離心收集細(xì)胞，加入RNase A(1 mg/mL)，37 ℃水浴30 min，再加入PI染色液(50 μg/mL) ，至4 ℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)STK15 mRNA表達(dá)的抑制情況

pGPU6/GFP/Neo-STK15質(zhì)粒及空載體pGPU6/GFP/ Neo轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定克隆后，采用RT-PCR檢測(cè)STK15 mRNA水平的表達(dá)。與對(duì)照組相比，篩選到的兩個(gè)STK15基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系(將其分別命名為pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2)中，STK15 mRNA表達(dá)水平明顯降低?；叶确治鲲@示，與對(duì)照組相比，pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2細(xì)胞中STK15 mRNA水平分別下調(diào)90%和88%。表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-STK15質(zhì)粒的細(xì)胞中STK15 mRNA的表達(dá)明顯受到抑制(圖1)。

圖 1 RNAi對(duì)STK15 mRNA表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of RNAi-STK15 on STK15 mRNA expression

2.2 Western blot檢測(cè)STK15蛋白表達(dá)的抑制情況

與對(duì)照組相比， pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2細(xì)胞系中，STK15 蛋白表達(dá)水平明顯降低?；叶确治鲲@示，與對(duì)照組相比，pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2細(xì)胞中STK15蛋白水平分別下調(diào)89%和85%。表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-STK15質(zhì)粒的細(xì)胞中STK15蛋白的表達(dá)也受到明顯抑制(圖2)。

圖 2 RNAi對(duì)STK15蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of RNAi-STK15 on STK15 protein expression

2.3 RNAi-STK15對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比， pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2細(xì)胞系的增殖能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明STK15基因沉默能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖(圖3)。

圖 3 RNAi-STK15對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響Fig. 3 Effect of RNAi-STK15 on SW480 cell proliferation

2.4 RNAi-STK15對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞技術(shù)分析顯示，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為3.8%，pGPU6-STK15-1和pGPU6- STK15-2細(xì)胞系的凋亡率分別為12.9%和11.8%(圖4A)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次后經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Western blot分析顯示，與對(duì)照組相比，pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2細(xì)胞系中，Caspase-3酶原蛋白表達(dá)量明顯降低，而Caspase-3剪切帶表達(dá)明顯增加(圖4B)。表明STK15基因沉默能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

圖 4 RNAi-STK15對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Effect of RNAi-STK15 on SW480 cell apoptosis

3 討 論

結(jié)直腸癌是較為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)。目前治療方法仍以傳統(tǒng)的放化療和手術(shù)治療為主，但預(yù)后較差。因此，尋求有效的結(jié)直腸癌治療方法至關(guān)重要。

人類STK15基因，又稱BTAK、ARK1、AIK1、STK6、Aurora-A、A urora-2，編碼一含403個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為46×103，屬于絲/蘇氨酸激酶家族成員［1-2］。許多研究表明STK15是一種潛在的癌基因，在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用［3-8］。Bischoff等［8］研究表明，STK15在結(jié)腸癌中也存在高表達(dá)。因此，抑制STK15基因的表達(dá)將可能為結(jié)腸癌的治療提供新的思路。RNA干擾技術(shù)是利用雙鏈RNA特異性地降解具有同源序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)［9］。由于其介導(dǎo)了精確的基因沉默，因此，通過RNA干擾抑制癌基因的表達(dá)成為了一種新的治療策略。研究報(bào)道，RNA干擾介導(dǎo)的沉默STK15基因的表達(dá)能抑制食管癌［10］和乳腺癌［11］等腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。而關(guān)于STK15基因干擾后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖和凋亡的影響鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究表明，通過將STK15基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-STK15轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，RT-PCR及Western blot均證實(shí)RNAi有效沉默了STK15基因的mRNA及蛋白表達(dá)。而且MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，STK15基因沉默能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)流式細(xì)胞技術(shù)分析證實(shí)，STK15基因沉默能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。我們進(jìn)一步通過檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)分析了STK15基因沉默對(duì)凋亡的影響。Caspase-3是一類天冬氨酸殘基特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。Caspase-3 在Caspase 家族介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于最后效應(yīng)階段，活化后的Caspase-3 促進(jìn)凋亡小體形成，是細(xì)胞凋亡最終的執(zhí)行者［12］。相對(duì)分子質(zhì)量為32×103的Caspase-3酶原在活化過程中從Asp28～Ser29和Asp175～Ser176兩處被剪切，從而裂解形成P17和P10兩個(gè)片段［13］。因此，通過檢測(cè)Caspase-3表達(dá)的變化可以反映細(xì)胞的凋亡情況。本研究表明，與對(duì)照組相比，STK15基因沉默組中Caspase-3酶原蛋白表達(dá)明顯降低，而Caspase-3剪切帶明顯增加，提示Caspase-3活化，從而進(jìn)一步證明STK15基因沉默能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，通過將靶向STK15的shRNA真核表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞可以高效特異地沉默人結(jié)腸癌細(xì)胞中STK15的表達(dá)。而STK15的表達(dá)沉默可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，本研究不僅提示了STK15有望成為結(jié)直腸癌基因治療中的新靶點(diǎn)，而且通過應(yīng)用RNA干擾的方法抑制STK15基因的表達(dá)將可能成為基因治療的新途徑。

［1］ MARUMOTO T, ZHANG D, SAYA H. Aurora-A- a guardian of poles ［J］. Nat Rev Cancer, 2005, 5(1): 42-50.

［2］ GREEN M R, WOOIERY J E, MAHADEVAN D. Update on aurora kinase targeted therapeutics in oncology ［J］. Expert Opin Drug Discov, 2011, 6(3): 291-307.

［3］ ZHOU H, KUANG J, ZHONG L, et al. Tumour amplified kinase STK15/BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation ［J］. Nat Genet, 1998, 20(2): 189-193.

［4］ WANG X, LU N, NIU B, et al. Overexpression of Aurora-A enhances invasion and matrix metalloproteinase-2 expression in esophageal squamous cell carcinoma cells ［J］. Mol Cancer Res, 2012, 10(5): 588-596.

［5］ LASSUS H, STAFF S, LEMINEN A, et al. Aurora-A overexpression and aneuploidy predict poor outcome in serous ovarian carcinoma ［J］. Gynecol Oncol, 2011, 120(1): 11-17.

［6］ XU H T, MA L, QI F J, et al. Expression of serine threonine kinase 15 is associated with poor differentiation in lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma ［J］. Pathol Int, 2006, 56(7): 375-380.

［7］ KUMANO M, MIYAKE H, TERAKAWA T, et al. Suppressed tumour growth and enhanced chemosensitivity by RNA interference targeting Aurora-A in the PC3 human prostate cancer model ［J］. BJU Int, 2010, 106(1): 121-127.

［8］ BISCHOFF J R, ANDERSON L, ZHU Y, et al. A homologue of Drosophila aurora kinase is oncogenic and amplified in human colorectal cancers ［J］. EMBO J, 1998, 17(11): 3052-3065.［9］ RAMACHANDRAN P V, IGNACIMUTHU S. RNA interference as a plausible anticancer therapeutic tool ［J］. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(6): 2445-2452.

［10］ WANG X, DONG L, XIE J, et al. Stable knockdown of Aurora-A by vector-based RNA interference in human esophageal squamous cell carcinoma cell line inhibits tumor cell proliferation, invasion and enhances apoptosis ［J］. Cancer Biol Ther, 2009, 8(19): 1852-1859.

［11］ LONG M, YIN G, LIU L, et al. Adenovirus-mediated Aurora A shRNA driven by stathmin promoter suppressed tumor growth and enhanced paclitaxel chemotherapy sensitivity in human breast carcinoma cells ［J］. Cancer Gene Ther, 2012, 19(4): 271-281.

［12］ MACKENZIE S H, CLARK A C. Death by caspase dimerization ［J］. Adv Exp Med Biol, 2012, 747: 55-73.

［13］ IGNEY F H, KRAMMER P H. Death and anti-death: tumor resistance to apoptosis ［J］. Nat Rev Cancer, 2002, 2(4): 277-288.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.013

R735.3+5

：A

：1007-3639(2013)06-0467-04

2012-12-27

2013-03-18）

國(guó)家自然科學(xué)基金(No：30973401)；山西省自然科學(xué)基金(No：2009011052)。

王曉霞 E-mail:wxiaoxia99007@yahoo.com.cn