吳婧文平波楊文韜吳小華張曉明楊慧娟

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科細胞室，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

3.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所分子病毒與免疫重點實驗室，上海 200025

宮頸癌及其前期病變患者外周血調(diào)節(jié)T細胞的差異分析

吳婧文1平波2楊文韜2吳小華1張曉明3楊慧娟1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科細胞室，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

3.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所分子病毒與免疫重點實驗室，上海 200025

背景與目的：調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg cells)可以抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，在惡性腫瘤的發(fā)生過程中，外周血中Treg細胞的數(shù)量隨著疾病的嚴重程度增加而增加。本研究旨在探討Treg細胞在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中可能產(chǎn)生的作用。方法：采用流式細胞術(shù)檢測61例宮頸鱗癌(squamous cell carcinoma，SCC)，8例宮頸腺癌(adenocarcinoma，ADC)，41例高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(high-grade cervical intraepithelial neoplasias，HG-CIN)患者和17例健康女性體檢者外周血中Treg細胞占CD4+T細胞的比率。結(jié)果：ADC、SCC、HG-CIN患者和健康對照者中Treg細胞占外周血CD4+T細胞的比率()分別為：(10.73±2.88)%、(10.31±2.45)%、(9.20±2.28)%和(7.88±1.18)%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。在宮頸鱗狀上皮病變中，外周血中Treg細胞的水平隨著病變的惡性程度增加逐漸升高(SCC＞HG-CIN＞NLM，P＜0.001)。在69例浸潤性宮頸癌中，根據(jù)2009 FIGO分期，I期為37例，Ⅱ期為32例。17例(24.6%)患者術(shù)后被發(fā)現(xiàn)有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。惡性程度較高的腫瘤中Treg細胞的數(shù)量高于惡性程度較低的腫瘤，包括FIGOⅡ期高于Ⅰ期[(10.67±2.67)% vs (10.00±2.24)%]、腫瘤直徑＞4 cm高于腫瘤直徑≤4 cm[(10.68±2.31)% vs (10.04± 2.63)%]、有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤[(11.06±2.56)% vs (10.13±2.44)%]。但統(tǒng)計檢驗未發(fā)現(xiàn)Treg細胞的數(shù)量和腫瘤的臨床分期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、腫瘤大小及纖維肌壁浸潤程度有相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論：宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌患者外周血中Treg細胞比例增高，并且與宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化的程度呈正相關(guān)，但其在浸潤性宮頸癌形成后的進展過程中的作用有待進一步探討。

調(diào)節(jié)性T細胞；流式細胞術(shù)；浸潤性宮頸癌；高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變

人類乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)的主要病因。HPV的感染是通過性接觸傳播，在人群中相當普遍，總的感染率約為17.7%，而這些人群中CINⅡ級的發(fā)生率為0.7%～1.5%，CINⅢ級以上發(fā)生率為0.6%～1.2%［1］。另外，絕大多數(shù)CINⅠ級患者的宮頸病變會自行消退，只有10%的患者進展為CINⅡ和Ⅲ級；CINⅡ級患者中，隨訪發(fā)現(xiàn)，其中40%～60%的宮頸病變消退，20%的病變進展為CINⅢ級，只有5%的病變進展為浸潤性宮頸癌；在CINⅢ級的患者中，30%～60%的病變消退，10%～40%的患者進展為浸潤性宮頸癌［2-3］。由此可見，病毒的感染在人群中相當普遍，但僅有極少數(shù)的患者會發(fā)展為宮頸癌。然而，HPV如何逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別，在上皮細胞內(nèi)形成持續(xù)感染直到惡性轉(zhuǎn)化的機理并未被完全闡明。

調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg cells)是一類具有免疫抑制作用的CD4+T淋巴細胞，為數(shù)不多，約占正常人CD4+T細胞的5%～10%［4］。近年來，在多種惡性腫瘤患者的外周血中均發(fā)現(xiàn)了Treg細胞比率升高，如乳腺癌［5］，胃癌［6］和原發(fā)性肝癌［7］。在宮頸癌中，國內(nèi)外已有研究表明，宮頸癌和高級別癌前期病變患者的外周血中Treg的比例較健康人群顯著升高。但有關(guān)Treg細胞在宮頸上皮受HPV病毒感染致惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)生進展轉(zhuǎn)移各階段中的作用的探討尚少［8-11］。本研究擬采用流式細胞術(shù)的方法比較宮頸癌、宮頸癌前期病變患者及正常人外周血中Treg細胞的比例，探討Treg細胞在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展各階段中可能的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2012年5—11月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科收治的61例宮頸鱗癌患者(squamous cell carcinoma，SCC)，8例宮頸腺癌患者(adenocarcinoma，ADC)，40例高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者(high-grade cervical intraepithelial neoplasia，HG-CIN)。另有17例健康女性體檢者作為正常對照，且既往均無宮頸病變及惡性腫瘤病史。上述患者和正常對照組的平均年齡分別為47.9(30～70)歲、46.6(29～61)歲、41.0(24～54)歲和42.1(25～54)歲，且均無心、腦、肝、腎等疾病，近3個月內(nèi)未使用任何抗腫瘤治療及免疫治療。

1.2 儀器和試劑

采用美國BD公司提供的FITC-抗CD4抗體、APC-抗CD25抗體和PE-抗CD127抗體。FACS Canto Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 標本采集和檢測

所有患者在入院接受宮頸錐切術(shù)前取靜脈血2 mL，EDTA抗凝。正常對照者在門診體檢時取血。取1根樣品測定管，加入50 μL抗凝血，依次加入FITC-抗CD4抗體10 μL、APC-抗CD25抗體2.5 μL、PE-抗CD127抗體10 μL，震蕩混勻，室溫避光溫育20 min；加入l mL溶血素，充分振蕩混勻，室溫避光放置10 min，500×g離心5 min棄上清液，加入PBS液l mL，再次離心洗滌后，所獲細胞加入PBS液500 μL，混勻后于流式細胞儀檢測。調(diào)整前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC，選定淋巴細胞群體并設(shè)門；以SSC為縱坐標，CD4為橫坐標，確定CD4+T細胞；再將CD4+T細胞設(shè)門，以CD25為橫坐標，CD127為縱坐標圈出CD4+CD25highCD127lowTreg細胞群，以CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+T細胞的百分比表示其數(shù)量。分析軟件為BD公司的Diva軟件。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。Treg細胞占外周血CD4+T細胞中的比例采用表示，多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間差異采用t檢驗。檢驗水準ɑ=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SCC、ADC、HG-CIN患者及正常對照者中Treg細胞占外周血CD4+T細胞的比例

圖 1 采用流式細胞術(shù)檢測宮頸癌及癌前期病變患者外周血Treg細胞的數(shù)量Fig. 1 Flow cytometry was used to measure the amounts of CD4+CD25highCD127lowTreg cells in peripheral blood from cervical cancers and precursors

Treg細胞通過表面表型CD4+CD25highCD127low識別。采用流式細胞儀檢測宮頸癌、HG-CIN患者和正常對照者的外周血中Treg細胞的散點圖(圖1)。結(jié)果SCC、ADC、HG-CIN患者和正常對照者中Treg細胞占外周血CD4+T細胞的比例分別為(10.31±2.45)%、(10.73±2.88)%、(9.20±2.28)%和(7.88±1.18)%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。SCC患者外周血中Treg細胞的數(shù)量顯著高于CIN患者及正常人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023，P＜0.001)。HG-CIN患者外周血中Treg細胞的數(shù)量高于正常人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)。8例ADC患者外周血中Treg細胞的數(shù)量與SCC患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.657)，但顯著高于正常人群(P=0.002)。

2.2 浸潤性宮頸癌患者中Treg細胞數(shù)量與臨床病理因素間的相關(guān)性分析

在69例浸潤性宮頸癌中，年齡＞40歲的患者外周血Treg細胞的比例高于年齡≤40歲的患者［(10.40±2.70)% vs (10.25±1.77)%］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.827)。惡性程度較高的腫瘤患者外周血Treg細胞的數(shù)量高于惡性程度較低的腫瘤患者，包括37例FIGOⅡ期患者外周血Treg細胞的比例高于32例FIGOⅠ期患者［(10.67±2.67)% vs (10.00±2.24)%］、腫瘤直徑＞4 cm高于腫瘤直徑≤4 cm［(10.68±2.31)% vs (10.04±2.63)%］、有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤［(11.06±2.56)% vs (10.13±2.44)%］。各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。這一結(jié)果提示，外周血Treg細胞的數(shù)目與反映浸潤性宮頸癌惡性程度的臨床病理危險因素間無相關(guān)性，包括高臨床分期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、腫瘤深肌層浸潤和腫瘤大體積等。

3 討 論

Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細胞，能夠抑制多種免疫細胞的活化、增殖和效應(yīng)功能，包括CD4+、CD8+T細胞、NK細胞、B細胞和抗原提呈細胞等，在自身免疫疾病、過敏癥、同種異體移植物耐受和妊娠期胎兒-母體耐受的預(yù)防中發(fā)揮主要作用［12-13］。另外，Treg細胞可以抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。并可以通過細胞-細胞間的直接接觸抑制機制或釋放多種免疫抑制因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等途徑在誘導(dǎo)腫瘤的T細胞耐受中發(fā)揮重要作用［14-15］。叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子-3(forkhead/ winged helix transcription factor-3，F(xiàn)oxp3)是Treg細胞生長發(fā)育和發(fā)揮抑制功能的重要因子，是目前識別Treg細胞最特異的指標。但由于Foxp3表達于細胞核內(nèi)，無法通過Foxp3直接染色進行活細胞分選Treg細胞。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)一群CD127表達下調(diào)的CD4+CD25+T細胞幾乎都表達Foxp3，且CD127的表達與FoxP3的表達呈負相關(guān)［16-17］。

表 1 浸潤性宮頸癌中外周血Treg細胞的數(shù)量和臨床病理因素間的相關(guān)性分析Tab. 1 Association between the frequencies of Treg cells in the peripheral blood and clinicopathological parameters among cervical cancer patients

Treg細胞主要由胸腺自然產(chǎn)生，外周血T細胞在抗原的刺激下也可誘導(dǎo)分化產(chǎn)生。隨著人體的衰老，胸腺產(chǎn)生Treg細胞的能力逐漸下降，但外周血可以代償性地產(chǎn)生Treg細胞以維持平衡。而這種平衡的喪失能否解釋老年人中易患免疫相關(guān)疾病、腫瘤或感染仍有爭議。Dejaco等［18］對14項研究的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，其中有11項研究證實在健康人群中Treg細胞占外周血CD4+細胞的比例和年齡無關(guān)。Molling等［8］對82例宮頸病變患者的分析發(fā)現(xiàn)外周血Treg細胞占CD4+T細胞的比例和年齡無關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

宮頸癌及其HG-CIN的發(fā)生和高危型HPV的持續(xù)感染有關(guān)。Treg細胞在病毒的慢性感染性疾病中發(fā)揮重要作用。Eggena等［19］研究表明，在人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者中移除外周血單核細胞中的CD4+CD25+Treg細胞可使抗HIV的CD4+T細胞反應(yīng)明顯增強。張蓓等［20］研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者的Treg細胞的比例顯著高于健康人群，且外周血Treg細胞的數(shù)量與血清HBV DNA拷貝數(shù)的對數(shù)呈正相關(guān)。Molling等［8］對82例宮頸細胞學(xué)異常的婦女的隨訪研究發(fā)現(xiàn)有HPV16持續(xù)感染的患者外周血中Treg細胞的比例明顯高于HPV陰性的患者(平均隨訪20個月)及HPV病毒在1年內(nèi)清除的患者(平均隨訪48個月)。這一結(jié)果提示，Treg細胞的免疫抑制功能在維持高危型HPV病毒的持續(xù)感染中有重要作用。

在惡性腫瘤的發(fā)生過程中，外周血Treg細胞的比例隨著疾病的病變嚴重程度增加而增加。Hiraoka等［21］報道在胰腺上皮由低級別胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN1A、PanINⅠB、PanINⅡ、PanINⅢ)進展為浸潤性導(dǎo)管癌過程中，組織中Treg細胞占CD4+細胞的比例隨著癌前期病變的嚴重程度增加而增加。而在宮頸上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程中，國內(nèi)外的多項研究發(fā)現(xiàn)低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的宮頸局部組織和外周血中Treg細胞的比例和健康人群差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但宮頸癌和HG-CIN患者明顯高于低級別患者及正常人群［13-14,22］。本研究未納入低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者，但進一步證實Treg細胞占外周血CD4+細胞的比例在HG-CIN和浸潤性宮頸癌中呈遞增趨勢，提示Treg細胞的免疫耐受作用可能主要在宮頸上皮惡變進展為高級別病變和浸潤性宮頸癌的階段中發(fā)揮作用。

在浸潤性癌中，多項研究證實Treg細胞可能和腫瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。在胰腺的浸潤性導(dǎo)管癌中，Treg細胞占CD4+T細胞的比例和腫瘤的分級、分期及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，且Treg細胞數(shù)量低的患者預(yù)后明顯好于Treg細胞數(shù)量高的患者［21］。Hou等［23］在宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤浸潤Treg細胞的數(shù)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。賈莉婷等［11］發(fā)現(xiàn)宮頸癌中FIGOⅡ期及Ⅲ期患者的外周血Treg的比例明顯高于Ⅰ期患者。而本研究中雖然發(fā)現(xiàn)惡性程度較高的腫瘤較惡性程度較低的腫瘤患者的Treg細胞數(shù)量多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能和樣本量有關(guān)，需要進一步擴大樣本量證實這一結(jié)果。

綜上所述，Treg細胞在宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化過程中有肯定的免疫抑制作用，但其在浸潤性宮頸癌形成后的進展過程中的作用及與預(yù)后的相關(guān)性有待進一步探討。

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Measurement of CD4+CD25highCD127low regulatory T cells in peripheral blood from cervical cancers and precursors

WU Jing-wen1, PING Bo2, YANG Wen-tao2, WU Xiao-hua1, ZHANG Xiao-ming3, YANG Hui-juan1(1.Department of Gynecologic Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 20032, China; 2.Department of Pathology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 20032, China; 3.Unit of Innate Defense and Immune Modulation, Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institute Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200025, China)

YANG Hui-juan E-mail: huijuanyang@hotmail.com

Background and purpose: High-risk types of human papillomavirus are the causative agents for cervical carcinogenesis. Regulatory T cells (Treg cells) characterized by CD4+CD25highCD127lowhave been shown to be involved in virus-induced persistent infection. Treg cells are found to be increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with solid tumors. The aim of this study was to compare the frequencies of Treg cells in the peripheral blood among cervical cancers and its precursors. Methods: Peripheral blood was collected from 61 patients with cervical squamous cell carcinomas (SCC), 8 patients with cervical adenocarcinomas (ADC), 41 patientswith high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 17 normal controls (NLM). Flow cytometry was employed to measure the frequency of CD4+CD25highCD127lowTreg cells among CD4+T cells in peripheral blood. The means of frequency of Treg cells were compared among groups using one-way ANOVA and t-test. Results: The frequency of Treg cells among CD4+T cells in the peripheral blood () was (10.73±2.88)%, (10.31±2.45)%, (9.20±2.28)% and (7.88±1.18)% in ADC cases, SCC cases, CIN cases and normal controls, respectively (P=0.001). Among squamous lesions, the amount of Treg cells was elevated and correlated with the severity of the disease (SCC＞CIN＞NLM, P＜0.001). The frequencies of Treg cells were higher in ADC cases compared to SCC cases, however, there was no statistic significance (P=0.657). Among the 69 invasive carcinomas, the mean age was 47.8 (29-70) years old. Thirtytwo and 37 patients were diagnosed as stage Ⅰand stage Ⅱ, respectively (FIGO staging 2009). Seventeen (24.6%) patients had pelvic lymph node metastasis. There was a trend that advanced cases had more Treg cells in their peripheral blood, however, no statistical difference was found between the amount of Treg cells and any clinico-pathologic parameters, such as FIGO stage [Ⅱ vs Ⅰ: (10.67±2.67)% vs (10.00±2.24)%, P=0.266], tumor size [＞4 cm vs ≤4 cm: (10.68±2.31)% vs (10.04±2.63)%, P=0.284] and lymph node metastasis[positive vs negative: (11.06±2.56)% vs (10.13±2.44)%, P=0.181]. Conclusion: The frequencies of Treg cells in peripheral blood were increased in patients with cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancers, which indicated that Treg cells might play a critical role in malignant transformation of cervical intraepithelium. However, their significance in the progression of invasive carcinomas warrants further study.

Regulatory T cells; Flow cytometry; Invasive cervical cancer; Cervical intrapithelial neoplasia

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.002

R737.33

：A

：1007-3639(2013)03-0167-06

2013-01-15

2013-03-10）

上海市衛(wèi)生局科研課題(No：2007140)。

楊慧娟 E-mail:huijuanyang@hotmail.com