北京大學(xué)第一醫(yī)院乳腺疾病中心，北京 100034

新輔助化療對乳腺癌組織因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和蛋白酶激活受體-2的表達及療效的影響

趙建新 林增茂 段學(xué)寧 劉蔭華

北京大學(xué)第一醫(yī)院乳腺疾病中心，北京 100034

背景與目的：組織因子(tissue factor，TF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是影響乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要因子，蛋白酶激活受體-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)是二者之間的介導(dǎo)因子。本研究旨在探討乳腺癌組織中TF、PAR-2和MMP-9表達的變化與乳腺癌新輔助化療療效的關(guān)系。方法：應(yīng)用二步法免疫組織化學(xué)方法檢測85例乳腺癌新輔助化療前后乳腺癌組織中TF、PAR-2和MMP-9的表達，分析新輔助化療前后其表達的變化與新輔助化療療效的關(guān)系。結(jié)果：85例乳腺癌新輔助化療患者病理完全緩解率(G5)為8.3%，其他患者在新輔助化療后TF、PAR-2和MMP-9陽性率均降低，其中MMP-9顯著降低(P＜0.05)。新輔助化療后，MMP-9表達陽性減弱的患者病理療效顯著好于陽性增強者(P＜0.05)；TF、MMP-9由陽性轉(zhuǎn)為陰性患者的病理療效顯著好于由陰性轉(zhuǎn)為陽性患者(P＜0.05)。PAR-2的改變則與病理療效無顯著關(guān)系。結(jié)論：乳腺癌新輔助化療后TF、MMP-9的陽性表達降低與病理緩解率相關(guān)，有助于判斷新輔助化療療效。

乳腺癌；組織因子；蛋白酶激活受體-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；新輔助化療

新輔助化療是乳腺癌全身治療的重要組成部分，新輔助化療前后細胞因子的變化可能對患者的治療和預(yù)后產(chǎn)生影響。組織因子(tissue factor，TF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)是影響乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要因子，蛋白酶激活受體-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)是二者之間的介導(dǎo)因子。因此，本研究旨在探討乳腺癌組織中TF、PAR-2和MMP-9的表達變化與乳腺癌新輔助化療療效的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2008年1月1日—12月31日北京大學(xué)第一醫(yī)院普通外科收治的經(jīng)空心針穿刺活檢病理診斷為乳腺癌的85例行新輔助化療患者，年齡29～71歲，臨床TNM分期：Ⅱ期59例，Ⅲ期26例，化療方案為TE：多西他賽75 mg/m2，表柔比星75 mg/m2，每3周1次，化療2～4個周期后手術(shù)，術(shù)后標本由同1位病理醫(yī)師閱片。術(shù)前病理分型：浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊型)79例，其他類型6例(浸潤性小葉癌4例，浸潤性篩狀癌1例，黏液癌1例)。組織學(xué)分級：1級23例，2級28例，3級34例。所有標本經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm。

1.2 TF、PAR-2和MMP-9蛋白檢測方法及結(jié)果判定

1.2.1 主要試劑

第一抗體：小鼠抗人TF單克隆抗體購自Abcam公司(1:100)，小鼠抗人MMP-9單克隆抗體和小鼠抗人PAR-2單克隆抗體均購自Santa Cruz公司。第二抗體：辣根酶標記山羊抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，PV9000免疫組化二步法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2.2 免疫組化染色

標本經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，60 ℃烤片7 h以上后行免疫組化染色。

采用二步法檢測TF、PAR-2和MMP-9蛋白的表達，按照試劑盒說明書操作。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，微波抗原修復(fù)，依次用第一抗體(TF一抗1:100、PAR-2一抗1:100、MMP-9一抗1:200)和第二抗體溫育，PBS洗片后DAB染色，Mayer氏蘇木素復(fù)染后封片。正常人肝臟組織(TF高表達)和正常人心肌組織(PAR-2、MMP-9高表達)為陽性對照，PBS替代第一抗體作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定

陽性評判標準參照文獻［1-2］的方法：每例觀察10個高倍鏡視野，連續(xù)計數(shù)不少于1 000個細胞，以腫瘤細胞的細胞質(zhì)(MMP-9)或細胞膜(TF和PAR-2)呈現(xiàn)棕黃色為陽性；陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性，按照陽性細胞數(shù)的多少量化為1+(10%)，2+(30%)，3+(70%)?；熀箨栃约毎麛?shù)減少(或增多)稱陽性減弱(或陽性增強)，即量變，其中由陽性轉(zhuǎn)為陰性或由陰性轉(zhuǎn)為陽性為質(zhì)變。

1.3 新輔助化療病理療效評價

患者在新輔助化療后接受全乳房切除術(shù)或保乳術(shù)，病灶組織根據(jù)病理(Miller-Payne系統(tǒng))進行療效評價［3］。1級(G1)：個別癌細胞有變化，但總數(shù)未減少；2級(G2)：＜30%癌細胞退變；3級(G3)：30%～90%的癌細胞退變；4級(G4)：＞90%的癌細胞退變；5級(G5)：未見浸潤癌細胞，可出現(xiàn)導(dǎo)管原位癌。G1和G2為未顯效，G3和G4為有效，G5為達到病理完全緩解。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過χ2檢驗判斷化療前后TF、PAR-2和MMP-9的表達變化及其與化療療效的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理療效

85例患者新輔助化療后，病理療效評價為G1為15例(17.6%)，G2為15例(17.6%)，G3為14例(16.5%)，G4為34例(40.0%)，G5為7例(8.3%)。未顯效(G1+G2)占35.29%，有效(G3+G4)占56.47%。

2.2 G5組患者的新輔助化療前TF、PAR-2和MMP-9蛋白表達情況

因G5病理完全緩解的標本無法進行腫瘤細胞的免疫組化染色，因此將這部分患者化療前免疫組化染色結(jié)果進行歸納(表1)。

2.3 新輔助化療前后TF、PAR-2和MMP-9蛋白表達情況變化

新輔助化療前后TF、PAR-2和MMP-9陽性率均降低(圖1～3)，其中MMP-9表達減少具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，3者的陽性表達量變和質(zhì)變的情況見表2。

2.4 新輔助化療前后TF、PAR-2和MMP-9的表達變化與化療療效的關(guān)系

新輔助化療后MMP-9表達陽性減弱的患者病理療效顯著好于陽性增強者(P=0.04)；TF和MMP-9由陽性轉(zhuǎn)為陰性的患者病理療效顯著好于由陰性轉(zhuǎn)為陽性患者(P＜0.05)，PAR-2的變化與化療療效無關(guān)(表3～5)。

表 1 達到病理完全緩解患者資料Tab. 1 The data of the pCR patients

表 2 新輔助化療前后TF、PAR-2和MMP-9蛋白表達變化Tab. 2 The change of TF, PAR-2 and MMP-9 expression pre and post neoadjuvant chemotherapy

圖 1 乳腺癌新輔助治療前后TF、PAR-2和MMP-9的表達情況Fig. 1 The expression of TF, PAR-2 and MMP-9 pre and post-chemotherapy (EnVision, ×400)

表 3 TF的表達與化療療效的關(guān)系Tab. 3 The relation between TF and chemotherapeutic response

表 4 PAR-2的表達與化療療效的關(guān)系Tab. 4 The relation between PAR-2 and chemotherapeutic response

表 5 MMP-9的表達與化療療效的關(guān)系Tab. 5 The relation between MMP-9 and chemotherapeutic response

3 討 論

新輔助化療已成為治療局部晚期乳腺癌患者的方法之一，具有早期全身治療、降低腫瘤分期、提高手術(shù)切除率和保乳率、術(shù)前體內(nèi)藥敏試驗、選擇個體化治療等優(yōu)點。新輔助化療的療效評估主要通過臨床體檢、影像學(xué)［4］和病理學(xué)檢查完成，其中金標準是病理檢查，免疫組化因子的變化在療效評估中的作用尚不明確。

TF和MMP-9可能通過影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等對化療的療效產(chǎn)生影響。在乳腺癌組織中兩者的陽性表達率可達40%以上［5］。Ueno等［6］研究表明，TF在乳腺癌中的表達可作為生存的獨立預(yù)后因素，對評價乳腺癌患者的遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供有效的前瞻性價值。Giannelli等［7］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌術(shù)后血清中MMP-9 的活性較術(shù)前顯著降低。MMP-9活性水平可作為術(shù)后重要的隨訪資料，王新友等［8］的研究也發(fā)現(xiàn)，血清MMP-9的活性水平與新輔助化療的療效顯著相關(guān)。湯堅強等［9］認為，在人白血病細胞中TF可通過PARs調(diào)控MMPs的表達，PAR-2可能是TF激活MMP-9分泌的重要介導(dǎo)因子。因此，新輔助化療對三者的作用可能影響患者的預(yù)后和療效評估。

本研究主要通過化療后腫瘤細胞密度和數(shù)量減低來評價療效，其中有7例患者達到G5，這些患者化療前TF、MMP-9、PAR-2的表達沒有顯示有規(guī)律性。新輔助化療不僅使得患者的腫瘤細胞數(shù)量和密度發(fā)生變化，也使得細胞的分子標志物的表達發(fā)生改變，其中，化療后MMP-9陽性表達率顯著降低，而TF、PAR-2的陽性表達也有所減少。這可能由于MMP-9是TF和PAR-2激活后的效應(yīng)因子，因此表達的降低更明顯。新輔助化療后TF、PAR-2和MMP-9發(fā)生量變的患者占全部患者的40%，發(fā)生質(zhì)變的患者占20%。蛋白表達的變化可能導(dǎo)致腫瘤對化療藥物耐藥，從而影響療效。研究結(jié)果還顯示，新輔助化療后MMP-9表達陽性減弱的患者療效顯著好于陽性增強者，TF和MMP-9由陽性轉(zhuǎn)為陰性的患者療效顯著好于由陰性轉(zhuǎn)為陽性患者，表明化療后出現(xiàn)TF、MMP-9的表達減少可能預(yù)示療效較好；而PAR-2表達與患者療效無關(guān)，這可能與PAR-2的表達陽性率較高有關(guān)，且PAR-2為多種信號通路蛋白，可能被其他蛋白影響，因此敏感性不高。部分患者在新輔助化療后TF、MMP-9表達由陰性轉(zhuǎn)為陽性，且多為療效較差患者，提示化療可能誘導(dǎo)TF和MMP-9表達增強，也可能與化療藥物耐藥有關(guān)。

因此，新輔助化療可使TF、MMP-9和PAR-2的陽性表達下降，三者的變化將有助于判斷新輔助化療的療效。

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The impact of neoadjuvant chemotherapy on the expression of tissue factor, protease activated receptor-2 and matrix metalloproteinase-9

ZHAO Jian-xin, LIN Zeng-mao, DUAN Xue-ning, LIU Yinhua (Breast Disease Centre, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)

ZHAO Jian-xin E-mail: zjxcn@yahoo.com.cn

Background and purpose: TF and MMP-9 are important factors for prognosis and metastasis of breast cancer, PAR-2 is the mediate factor of them, this study aimed to evaluate the change of expressions of TF PAR-2 and MMP-9 in breast cancer patients after neoadjuvant chemotherapy and their correlations with pathologic response. Methods: The expressions of TF, PAR-2 and MMP-9 in 85 breast cancer tissues were examined by immunohistochemical technique (SP) before and after neoadjuvant chemotherapy. Correlation analysis were made between the change of expressions and pathologic response. Results: The strictly pathologic completely response rate (G5) was 8.3% in 85 breast cancer patients after neoadjuvant chemotherapy. The decrease of expression of MMP-9 after neoadjuvant chemotherapy was statistically significant correlations with pathological response (P＜0.05). The expression changes of TF and MMP-9 from positive to negative was statistically significant correlated with tumor pathological response(P＜0.05). The expression change of PAR-2 showed rarely significant (P＞0.05). Conclusion: The decrease of expression of TF and MMP-9 after neoadjuvant chemotherapy have statistically significant correlations with pathological response, would be probably useful for estimating the effect of neoadjuvant chemotherapy.

Breast cancer; TF; PAR-2; MMP-9; Neoadjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.007

R737.9

：A

：1007-3639(2013)03-0195-05

2012-10-10

2013-02-24）

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趙建新 E-mail:zjxcn@yahoo.com.cn

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