何曉芬,方劍喬,蔣永亮,黃壘,裘晟晨,沈亞芳,尹小虎

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電針治療慢性炎性痛的促外周beta-END釋放作用

何曉芬,方劍喬,蔣永亮,黃壘,裘晟晨,沈亞芳,尹小虎

(浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

觀察電針治療慢性炎性痛時對炎癥局部炎性介質(zhì)和外周阿片肽的雙重干預(yù)作用。建立大鼠弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型,電針選用患側(cè)足三里和昆侖穴,并與傳統(tǒng)非甾體抗炎藥消炎痛進(jìn)行比較,觀察熱縮腿閾(thermal paw withdrawal latency,PWL)變化,檢測足跖炎癥組織前列腺素E2(PGE2)、白介素-1b(IL-1b)和beta-內(nèi)啡肽(beta-END)。電針和消炎痛均可提高慢性炎性痛大鼠痛閾;電針不能顯著降低炎癥局部組織PGE2、IL-1b水平,但能顯著升高炎癥局部組織beta-END水平(＜0.05);消炎痛能顯著降低PGE2和IL-1b水平(均＜0.01),但對beta-END水平?jīng)]有顯著影響。與傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥相比,電針治療慢性炎性痛具有促外周beta-END釋放的作用。

電針;慢性炎性痛;炎性介質(zhì);阿片肽;內(nèi)啡肽;大鼠

慢性炎性痛是臨床上的常見癥狀,治療多采用抗炎鎮(zhèn)痛藥,但長期使用常伴隨嚴(yán)重的胃腸道毒副反應(yīng)[1-3],其相應(yīng)的機理研究也多局限于對炎性介質(zhì)干預(yù)方面[4]。電針是臨床上治療慢性炎性痛的常用手段,具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[5-6]。針刺鎮(zhèn)痛的中樞阿片機制已被證實,但外周阿片肽是否參與針刺鎮(zhèn)痛尚未明確。有研究表明[7],炎癥局部的免疫細(xì)胞可釋放阿片肽,參與外周鎮(zhèn)痛。電針能否作為一種有效刺激促進(jìn)炎癥局部阿片肽的釋放,進(jìn)而發(fā)揮治療慢性炎性痛的作用,目前缺少相應(yīng)研究。本研究立足于電針治療慢性炎性痛是否存在對炎癥局部炎性介質(zhì)和外周阿片肽的外周雙重調(diào)節(jié)機制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康雄性Wistar大鼠32只,體重為(170±10)g,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心[SCXK (滬)2008-0016],由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng)(由實驗動物中心提供)及自由飲水,12 h循環(huán)燈光。

1.2 針具、藥物和試劑

0.25 mm×13 mm無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);消炎痛片劑(廣東華南藥業(yè)有限公司)。弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)由美國Sigma公司提供;PGE2EIA kit由美國Enzo公司提供; IL-1bEIA kit由美國Raybiotech公司提供;TNF-aEIA kit由美國Raybiotech公司提供;beta-END送至上海第二軍醫(yī)大學(xué)應(yīng)用RIA kit檢測。

1.3 儀器設(shè)備

足底測量儀(意大利UGO BASILE公司)、韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)、BECKMAN超高速離心機(美國貝克曼儀器公司)、紫外分光光度計(美國BIO-RAD公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模和分組

利用SPSS軟件,采用完全隨機分組法將大鼠分為4組,每組8只,分別為正常組、模型組、電針組、消炎痛組。除正常組不造模,僅注射等劑量生理鹽水,其余各組大鼠均于右后足足底內(nèi)注射CFA(0.1 mL/只),建立慢性炎性痛模型。

1.4.2 治療方法

電針組取患側(cè)足三里、昆侖穴(定位參照華興邦大鼠穴位圖譜)進(jìn)行電針治療。電針采用LH-202H韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀(北京華為產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司),治療的參數(shù)為疏密波,2/100 Hz,1～2 mA(每15 min增加1 mA)。治療時間為30 min,每日1次。消炎痛組按1.5 mg/kg劑量每日灌胃治療1次。治療均從造模后第1天開始至第18天處死大鼠。模型組大鼠造模后不做治療處理,但在造模后第1天至第18天予以電針組相同的固定。

1.4.3 痛閾測量

采用足底測量儀(dynamic plantar aesthesiometer 37370,UGO BASILE)檢測大鼠患足熱縮腿閾(Thermal Paw Withdrawal Latency,PWL)作為痛閾指標(biāo)。于造模前及造模后1 d、4 d、18 d檢測所有實驗大鼠右后足熱縮腿閾。具體操作為測量前將大鼠置于透明塑料盒中,待大鼠安靜后(停止梳理毛發(fā)和探索性活動),將聚焦的紅外熱源置于大鼠右后足中央,避開足墊,啟動“START”按鈕對足底進(jìn)行熱刺激,儀器自動記錄大鼠縮足反應(yīng)時的潛伏期和紅外輻射強度。20 s是刺激時間最上限,30為最大熱輻射強度。連續(xù)測量3次,每次間隔5 min。

1.4.4 ELISA測定足跖炎癥組織PGE2、IL-1b含量

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測足跖炎癥組織PGE2、IL-1b含量。取足跖炎癥組織,研碎,按1 mg組織加100mL裂解液(江蘇碧云天)和1mL蛋白酶抑制劑(加拿大biobasic)比例加入配好的裂解液,冰浴中超聲粉碎,高速低溫離心后,取上清。分別按試劑盒說明書檢測PGE2、IL-1b含量(pg/mg)。

1.4.5 RIA測定足跖炎癥組織beta-END含量

采用放射免疫分析法。取足跖炎癥組織,研碎,按1 mg組織加100mL裂解液(江蘇碧云天)和1mL蛋白酶抑制劑(加拿大biobasic)比例加入配好的裂解液,冰浴中超聲粉碎,高速低溫離心后,取上清。將提取的上清液送至上海第二軍醫(yī)大學(xué)應(yīng)用RIA檢測足跖炎癥組織beta-END含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)均用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表達(dá),多組間比較采用單因素方差分析,析因分析采用檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對大鼠患側(cè)PWL變化的影響

由表1可見,各組大鼠造模前基礎(chǔ)PWL比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。模型組足趾注射后,模型組、電針組、消炎痛組PWL與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),提示慢性炎性痛模型成功建立。電針組、消炎痛組治療后PWL與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。電針組治療18 d后PWL與消炎痛組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。

表1 各組大鼠患側(cè)熱縮腿閾比較 (±s,s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.2 電針對足跖炎癥組織PGE2含量的影響

由表2可見,造模后18 d,模型組大鼠足跖炎癥組織的PGE2含量顯著升高(＜0.01,與正常組比較)。與模型組比較,電針組PGE2含量有降低趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。消炎痛組治療后PGE2含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。

表2 各組大鼠足跖炎癥組織PGE2含量比較(±s,pg/mg)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 電針對足跖炎癥組織IL-1b含量的影響

由表3可見,造模后18 d,模型組大鼠足跖炎癥組織的IL-1b含量顯著升高(＜0.01,與正常組比較);與模型組比較,電針組IL-1b含量有降低趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。消炎痛組治療后IL-1b含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

表3 各組大鼠足跖炎癥組織IL-1b含量比較(±s,pg/mg)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05

2.4 電針對足跖炎癥組織beta-END含量的影響

由表4可見,造模后18 d,模型組大鼠足跖炎癥組織的beta-END含量與正常組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。

電針組治療后大鼠足跖炎癥組織的beta-END含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。消炎痛組治療后大鼠足跖炎癥組織的beta-END含量與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。

表4 各組大鼠足跖炎癥組織beta-END含量比較(±s,pg/mg)

注:與模型組比較1)＜0.05

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“經(jīng)脈者,所以能決死生,處百病,調(diào)虛實,不可不通?！弊凇安∈加谧忝?先取足陽明而汗出”的治療原則,我們選取足三里穴為治療主穴。昆侖穴具有通利關(guān)節(jié)、舒經(jīng)活絡(luò)止痛作用,所以我們同時選用昆侖穴進(jìn)行治療。有研究表明,以疼痛局部或鄰近穴位電針效果最佳[8-10]。國內(nèi)也有研究表明[11],足三里和昆侖穴可以減輕由弗氏完全佐劑引起的慢性炎性痛,并且具有良好的治療作用。

CFA模型是炎性痛的經(jīng)典模型,在造模后1 d即可出現(xiàn)足跖局部的紅、腫、熱、痛等炎癥癥狀,疼痛可持續(xù)4星期[12],是研究針灸治療慢性炎性痛機制的理想模型[13]。電針鎮(zhèn)痛作用已被廣泛證實,與以往的研究結(jié)果一致[14-15],我們發(fā)現(xiàn)電針對慢性炎性痛有良好的治療作用,且療效類似傳統(tǒng)的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥消炎痛,但在降低局部炎癥組織的PGE2、IL-1b等炎性因子水平方面,電針作用不如消炎痛。因此,電針治療慢性炎性痛可能還存在其他的調(diào)節(jié)途徑。

內(nèi)源性阿片肽(EOP)的外周鎮(zhèn)痛作用日益引起人們的注意。研究表明,炎癥過程中,內(nèi)含阿片肽的免疫細(xì)胞在黏附分子等導(dǎo)向下聚集于足跖炎癥組織,遷移到炎癥局部的免疫細(xì)胞(T、B淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,單核細(xì)胞)可合成大量的EOP[16]。在有效的刺激下,這些免疫細(xì)胞可釋放EOP,作用于炎癥局部感覺神經(jīng)末梢上的阿片受體,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。有報道冷水游泳可促使炎癥局部EOP的釋放[17]。那么,電針能否作為一種有效刺激促使外周EOP的釋放呢?在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)電針能顯著提高慢性炎癥痛大鼠炎癥局部的beta-END含量,而消炎痛沒有明顯的影響;之前有研究也表明,足跖注射阿片受體拮抗劑納洛酮可拮抗電針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[18]。這些結(jié)果表明,外周beta-END參與電針的治療慢性炎性痛作用。這就很好解釋了本實驗中為何電針在改善局部炎性因子方面作用不如消炎痛,而鎮(zhèn)痛作用卻與之相當(dāng)。本研究結(jié)果表明,電針治療慢性炎性痛可能涉及外周阿片機制,其中beta-END是重要的環(huán)節(jié)。

[1] Roth SH. Coming to terms with nonsteroidal anti-inflammatory drug gastropathy[J]Drugs, 2012,72(7):873-879.

[2] Peskar BM, Maricic N, Gretzera B,. Role of cyclooxygenase-2 in gastric mucosal defense[J]. Life Sci, 2001,69(25-26): 2993-3003.

[3] Shigeta J, Takahashi S, Okabe S. Role of cyclooxygenase-2 in the healing of gastric ulcers in rats[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1998,286 (3):1383-1390.

[4] Feldmann M, Brennan FM, Maini RN. Role of cytokines in rheuma- toid arthritis[J]. Annu Rev Immunol, 1996,14:397-440.

[5] Berman MD, Langevin HM, Witt CM,. Acupuncture for chronic low back pain[J]. N Engl J, 2010,363(5):454-461.

[6] Xin BY. Observation on therapeutic effect of electro-acupuncture in the treatment of chronic low back pain：a report of 30 cases[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2005, 3(4):35-36.

[7] Zhu L, Li C, Ji C,. The role of OLS in peripheral acupuncture analgesia in arthritic rats[J]. Zhen Ci Yan Jiu, 1993,18(3):214-218.

[8] 趙聰,余劍波.電針對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓P2X3受體表達(dá)的影響[J].國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2013,34(1):31-35.

[9] 李紅英,馬薇濤,于衛(wèi),等.電針鎮(zhèn)痛與神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓大麻素2受體表達(dá)[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(24):4068-4070.

[10] 沈利榮,顧陳懌,丁依紅,等.針?biāo)帍?fù)合麻醉對腸癌患者術(shù)后鎮(zhèn)痛效果的影響[J].上海針灸雜志,2011,30(2):77-79.

[11] 李娜,李為民,陳穎波.電針對弗氏完全佐劑性小鼠外周慢性炎癥痛的緩解作用[J].中國針灸,2008,28(2):122-126.

[12] Yu L, Yang F, Luo H,. The role of TRPV1 in different subtypes of dorsal root ganglion neurons in rat chronic inflammatory nociception induced by complete Freund’s adjuvant[J]. Mol Pain, 2008,4:61.

[13] Beyer A, Sch?fer M, Stein C. Antinociceptive effects of dynorphin peptides in a model of inflammatory pain[J]. Pain, 1997,70 (2-3):141-147.

[14] 方劍喬,邵曉梅,馬桂芝.電針“足三里”“三陰交”穴對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞分泌功能的影響[J].針刺研究,2009,34(2): 93-96.

[15] 方劍喬,邵曉梅,梁宜,等.電針治療CIA大鼠慢性炎癥及對COX-2的選擇性抑制作用[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2006,30 (2):169-173.

[16] Rittner HL, Machelska H, Stein C. Leukocytes in the regulation of pain and analgesia[J]. J Leukoc Biol, 2005,78(6):1215-1222.

[17] 羅非,韓濟(jì)生.阿片樣物質(zhì)的外周鎮(zhèn)痛作用[J].生理科學(xué)進(jìn)展,1993,24(1):64-66.

[18] Zhang GG, Yu C, Lee W,. Involvement of peripheral opioid mechanisms in electroacupuncture analgesia[J]. Explore (NY), 2005,1(5):365-371.

Peripheral Beta-END Release-promoting Effects of Electroacupuncture in the Treatment of Chronic Inflammatory Pain

-,-,-,-,-,-.

,310053,

To investigate the dual intervening effects of electroacupuncture on inflammatory mediators and peripheral opioid peptides in local inflammatory tissue in the treatment of chronic inflammatory pain.A rat model of complete Freund’s adjuvant (CFA)-induced chronic inflammatory pain was made. Electroacupuncture at points Zusanli and Kunlun on the affected side were compared with conventional nonsteroidal anti-inflammatory drug indomethacin. Paw withdrawal latency (PWL), and prostaglandin E2(PGE2), interleukin-1b(IL-1b) and beta-endorphin (beta-END) in the plantar inflammatory tissue were measured.Both electroacupuncture and indomethacin raised pain threshold in the rats with chronic inflammatory pain. Electroacupuncture did not significantly reduce PGE2 and IL-1blevels but significantly increase beta-END levels (＜0.05) in the local inflammatory tissue. Indomethacin significantly increased PGE2 and IL-1blevels (both＜0.01) but did not produce a significant effect on beta-END levels.Electroacupuncture can promote peripheral beta-END release in the treatment of chronic inflammatory pain compared with the conventional nonsteroidal anti-inflammatory drug.

Electroacupuncture; Chronic inflammatory pain; Inflammatory mediator; Opioid peptide; Endorphin; Rats

1005-0957(2013)05-0407-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.05.407

2012-12-18

國家自然科學(xué)基金資助項目(81072855);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(Z2100979,LY12H27015);浙江省“重中之重”學(xué)科(針灸推拿學(xué))建設(shè)經(jīng)費資助[浙教高科(2008)255號]

何曉芬(1986 - ),女,2010級碩士生

方劍喬(1961 - ),男,教授