李娜，張莉，郭敏

(遼寧醫(yī)學院組織胚胎學教研室，遼寧 錦州 121001)

神經病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是由于感染、外傷、腫瘤等原因導致的神經系統(tǒng)損傷后的一種慢性疾病狀態(tài)，其主要的臨床病理生理學特點是痛覺過敏、痛覺超敏、感覺缺失及自發(fā)疼痛等［1－3］。近年來，NPP 的發(fā)病率逐年增高，由于缺乏有效的治療手段，因此已經嚴重影響了患者的生存質量。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓后角神經細胞凋亡是NPP發(fā)病的重要機制之一［4］，而微量元素鋅可能參與了NPP 的形成與傳導［5］，因此，為了深入研究鋅參與NPP 的可能機制，本研究擬應用免疫組織化學技術、免疫印跡技術和圖像分析技術檢測鋅預處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角caspase－9 的表達的影響，從而為深入研究鋅參與NPP 的發(fā)病機制提供基礎的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

8 周齡C57/BL6 小鼠48 只，雌雄各半，體重30～40 g，隨機分為4 組:(1)對照組(Con):正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射生理鹽水;(2)N－CAP 組:正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (3)L－CAP組:低鋅喂養(yǎng)(鋅:0.85 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (4)H－CAP 組:高鋅喂養(yǎng)(飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 取材與標本制備

足底注射辣椒素后7 d，取小鼠腰5 節(jié)段脊髓，一部分用于免疫印跡檢測，一部分經4%多聚甲醛固定12 h 后制備5 μm 厚的石蠟切片備用。

1.3 免疫組織化學染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復。0.01 M PBS 沖洗5 min ×3 次;滴加3%H2O2室溫10 min;PBS 沖洗5 min×3 次;滴加正常非免疫動物血清，常溫10 min;滴加兔抗小鼠多克隆caspase－9 抗體(1∶100)，4 °C 過夜;PBS 沖洗5 min×3 次;山羊抗兔IgG (1∶200)，室溫孵育10 min;PBS 沖洗5 min×3 次;鏈霉素抗生物素—過氧化物酶室溫孵育10 min;PBS 沖洗5 min×3 次;DAB 顯色3～10 min，蘇木精復染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫印跡檢測

脊髓稱重后按1∶5 的比例加入0.9%NaCl 溶液，于冰上剪碎樣品，4 ℃低溫離心，棄上清，按1∶5 比例加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，4 ℃低溫離心30 min，取上清，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。樣品水浴煮沸5 min 后進行10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓為90 V，分離膠轉為110 V。轉膜、3%牛血清封閉3 h 后加入一抗稀釋液(兔抗小鼠多克隆抗體，caspase－91∶200)4 ℃過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5000)室溫下孵育2 h。用ECL 發(fā)光試劑盒顯像。

1.5 圖像分析與統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色結果

Caspase－9 免疫組織化學陽性反應產物為棕褐色顆粒狀，主要表達在小鼠脊髓后角淺層神經元的細胞質中。其中，對照組(Con 組)脊髓后角有少量Caspase－9 陽性反應產物。與Con 組相比較，其它3 組模型動物脊髓后角淺層的陽性反應產物均顯著增多;其中，L－CAP 組的陽性反應產物最密集;H－CAP 組的陽性反應產物最稀疏(圖1)。

2.2 圖像分析結果

圖像分析顯示，與對照組(Con 組)比較，其它三組的光密度值顯著增高(P ﹤0.01)，其中，L－CAP 組的光密度值最高(P ﹤0.01)，H－CAP組的光密度值最低(P ﹤0.01)(圖2)。

2.3 免疫印跡結果

經免疫印跡顯影后，可確認有Caspase－9 蛋白條帶。圖像分析顯示:與對照組(Con 組)相比較，其它三組的Caspase－9 蛋白表達均顯著增高(P ﹤0.01)。其中，L－CAP 組的表達最高，H－CAP 組的表達最低(P ﹤0.01)(圖3)。

3 討 論

神經病理性疼痛是由中樞或外周神經系統(tǒng)損傷而引起的不愉快感覺和情緒體驗，即通常所指的慢性疼痛。創(chuàng)傷、代謝性疾病、腫瘤化療、手術、射線、神經毒性藥物、神經受壓缺血、炎癥和腫瘤的侵襲都可引起神經性疼痛［6］。它與急性疼痛不同，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛(針刺、電灼、撕裂、刀割樣疼痛)和誘發(fā)性疼痛(即感覺異常和痛覺過敏)，可以持續(xù)存在，對機體無益，甚至會嚴重影響生活質量。

研究發(fā)現(xiàn)，NPP 的發(fā)病機制復雜，分為中樞機制與外周機制。其中，神經損傷可引起PKC 激活，后者促使轉錄因子環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白激活，調節(jié)即刻早期基因c－fos 和c－Jun 的轉錄和表達，從而激活其下游的c－Jun 激酶，引起脊髓表層神經元和中間抑制性神經元的凋亡，這也是脊髓敏化形成的重要因素。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase)是細胞凋亡的分子機制中重要的效應因子，其中caspase－ 9 作為起始caspase，它能感受上游凋亡信號，引起下游caspase 活化，參與由細胞色素－C 激活的內源性細胞凋亡途徑，從而最終激活下游的效應因子caspase－3、7，使細胞骨架蛋白和細胞修復酶等靶蛋白裂解，發(fā)生細胞凋亡［7］。傅［4］25－28等發(fā)現(xiàn)，大鼠足底皮下注射福爾馬林能導致脊髓后角神經元凋亡。胡［8］等發(fā)現(xiàn)，慢性坐骨神經壓迫性損傷可以引起大鼠脊髓后角凋亡神經元數(shù)量顯著增多。本研究結果與上述結果相符，足底注射辣椒素后，小鼠脊髓后角淺層caspase－9 的表達顯著增高，光密度值增多;免疫印跡分析也顯示caspase－9 蛋白表達增多。

近年來的研究顯示，微量元素鋅可能與NPP的產生與傳遞有著密不可分的關系。據(jù)相關報導［9－10］，鋅離子能影響非NMDA 受體的表達與功能，而這個受體在傷害性刺激傳導過程中起著非常重要的作用。Jo 等［11］將動物的脊神經背根切斷，用金屬自顯影技術發(fā)現(xiàn)在脊髓背側角的淺層，鋅離子的分布顯著減少，同時伴隨小鼠機械痛閾值的降低，小鼠出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，推斷鋅可能參與了痛覺的傳導。本研究應用免疫組織化學技術、免疫印跡技術和圖像分析技術發(fā)現(xiàn)，高鋅預處理可以使辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角淺層的caspase－9 蛋白表達減少，光密度值降低;而低鋅預處理能使caspase－9 的表達增多，光密度值增高，提示鋅能抑制NPP 模型動物脊髓后角神經元凋亡。

本研究利用免疫組織化學技術、免疫印跡技術和圖像分析技術分析了鋅預處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角淺層caspase－9 蛋白表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)足底注射辣椒素后，脊髓后角淺層caspase－9 的表達顯著增多，高鋅預處理使caspase－9 的表達上調，低鋅預處理使蛋白表達下調，提示鋅可能抑制了模型動物脊髓后角caspase－9 的表達，從而抑制了神經元的凋亡，但是其具體的抑制機制還需要進行深入的研究。

圖1 免疫組織化學染色顯示caspase－9 在各組模型動物脊髓的分布，×400

圖2 各組小鼠脊髓的光密度值(caspase－9 免疫組化染色圖像分析，，n=6)

圖3 免疫印跡檢測caspase－9 在各組小鼠脊髓的表達(，n=6)

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