孫發(fā)政，種曉迪

(1棗莊市中區(qū)人民醫(yī)院，山東棗莊277100;2棗莊市立三院)

中性肽鏈內(nèi)切酶 (NEP)是存在于細(xì)胞膜表面的Ⅱ型膜蛋白，屬含鋅金屬肽酶M13家族中的一員;氨基肽酶N(APN)也是一種是Ⅱ型膜蛋白，因能夠從肽、酰氨和芳酰氨的N端水解氨基酸而得名。既往，這兩種蛋白主要用于急性白血病和惡性淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤的診斷與鑒別，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)非造血系統(tǒng)腫瘤的診斷、鑒別診斷也有重要指導(dǎo)意義。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測NEP、APN在肺癌、肺良性腫瘤及正常肺組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為肺癌的診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2004年7月～2010年12月在棗莊市中區(qū)人民醫(yī)院胸科經(jīng)手術(shù)治療、術(shù)前均未行放化療及其他相關(guān)治療、病理診斷明確、病史完整的病例作為研究對(duì)象。肺癌73例，病理分型為鱗癌27例，腺癌30例，小細(xì)胞肺癌16例;TNM分期Ⅰ期15例，Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期40例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。肺良性腫瘤組織26例，取自結(jié)核球11例，炎性假瘤6例，錯(cuò)構(gòu)瘤8例，纖維化結(jié)節(jié)1例。正常肺組織20例，取自距癌腫邊緣5 cm以上的正常肺組織，并經(jīng)病理檢查證實(shí)無癌細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 NEP、APN檢測方法 采用免疫組織化學(xué)染色SP法。根據(jù)病理結(jié)果，選取肺癌組織豐富的石蠟塊，連續(xù)切片，厚度4μm。脫蠟、水化、微波抗原修復(fù);加入過氧化氫，正常非免疫動(dòng)物血清封閉，孵育10 min;滴加一抗，4℃過夜;滴加生物素標(biāo)記二抗，鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液，孵育10 min;DAB顯色，蘇木精復(fù)染。NEP、APN陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。依據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞數(shù)判斷:無陽性染色及陽性細(xì)胞為-，著色淡或陽性細(xì)胞＜25%為+，著色適中或陽性細(xì)胞占25%～50%為++，著色深或陽性細(xì)胞≥50%為+++。+～+++者均判為陽性表達(dá)。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。構(gòu)成比或率的比較采用χ2或 Fisher's檢。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEP、APN在不同肺組織中的表達(dá) 肺癌組織中NEP、APN陽性表達(dá)率分別為32.88%(24/73)、41.11%(30/73)，肺良性腫瘤組織中分別為88.46%(23/26)、15.38%(4/26)，正常肺組織中分別為 95.00%(19/20)、5.00%(1/19);肺癌組織中NEP、APN陽性表達(dá)率與肺良性組織、正常肺組織比較，P 均 ＜0.01。

2.2 NEP、APN表達(dá)與肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系NEP、APN表達(dá)與肺癌的臨床分期、組織分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，見表1。

3 討論

NEP有著廣泛的組織定位和作用底物，通過裂解生物活性肽，間接調(diào)解蛋白質(zhì)代謝，對(duì)細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡具有重要的生理調(diào)節(jié)作用［1］。最新研究認(rèn)為，NEP在不同組織中的表達(dá)及活性變化與某些疾病的發(fā)生和預(yù)后有一定聯(lián)系［2］。NEP減少可以引起神經(jīng)源性肽分泌增加而降解減少，神經(jīng)源性肽是導(dǎo)致肺癌發(fā)病的自分泌/旁分泌生長因子［3］。APN一般均勻地分布在細(xì)胞膜表面，當(dāng)腫瘤細(xì)胞形成克隆時(shí)，APN分子自動(dòng)遷移到細(xì)胞與細(xì)胞的接觸部位。腫瘤細(xì)胞通過該蛋白酶對(duì)基底膜成分(基膜和Ⅳ型膠原蛋白)的水解作用，進(jìn)行組織消化穿透;同時(shí)誘導(dǎo)周圍間質(zhì)細(xì)胞的肌纖維母細(xì)胞化，及間質(zhì)中腫瘤血管的增生，促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［4］。

表1 NEP、APN表達(dá)與肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

Shousha等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在肝硬化發(fā)展中，出現(xiàn)NEP染色方面的變化具有重要臨床意義;隨著肝纖維化加重或廣泛腫瘤轉(zhuǎn)移，NEP染色逐漸下降，其病變機(jī)制尚不明確。而在肺癌患者的血漿及腫瘤中，APN 表達(dá)明顯升高［6，7］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEP在肺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯降低(32.88%)，且多為弱陽性;在肺良性腫瘤組織(88.46%)和正常肺組織組織(95.00%)中的表達(dá)率較高，多為強(qiáng)陽性。而APN在肺癌組織中的表達(dá)(41.10%)明顯高于肺良性腫瘤(15.38%)和正常肺組織(5.00%)，并且在肺良性腫瘤和正常肺組織中APN的表達(dá)多呈弱陽性。這一結(jié)果提示，NEP和APN表達(dá)及活性變化與肺癌的發(fā)生有一定聯(lián)系，同時(shí)檢測NEP、APN對(duì)于肺惡性腫瘤的診斷及與鑒別診斷有重要價(jià)值。Nahye Myong［8］在相關(guān)研究中，未發(fā)現(xiàn)吸煙和非吸煙人群中NEP表達(dá)存在顯著差異。本組研究發(fā)現(xiàn)，NEP、APN在吸煙者和非吸煙者腫瘤組織中的表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。筆者認(rèn)為，雖然吸煙是導(dǎo)致肺癌的重要誘因，但尚不能認(rèn)為吸煙是導(dǎo)致NEP、APN在肺癌中表達(dá)降低或缺失的潛在機(jī)制。

有研究發(fā)現(xiàn)，NEP表達(dá)下降可促進(jìn)前列腺癌、腎癌患者術(shù)后的局部復(fù)發(fā)［9］，而APN陽性表達(dá)的腫瘤患者往往惡性程度高、預(yù)后差［10］，本研究發(fā)現(xiàn)，NEP、APN表達(dá)與肺癌臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)。即肺癌臨床分期晚、分化程度越低及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，NEP表達(dá)陽性率越低;而APN表達(dá)正好相反，即肺癌臨床分期越晚、分化程度越低及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，APN表達(dá)陽性率越高。這說明NEP、APN肺表達(dá)對(duì)肺癌惡性程度的判斷、預(yù)后評(píng)估及制定下一步治療方案有重要指導(dǎo)意義。

［1］Sumitomo M，Shen R，Nanus DM.Involvement of neutral endopeptidase in neoplastic progression［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1751(1):52-59.

［2］Maguer-Satta V，Besan?on R，Bachelard-Cascales E，et al.Concise review:neutral endopeptidase(NEP):a multifaceted environment actor in stem cells，physiological mechanisms，and cancer［J］.Stem Cells，2011，29(3):389-396.

［3］Masanori Y，Johbu I，Yoshihiro S，et al.Availability of NEP as a histopathological diagnostic marker［J］. Acta Histochem Cytochem，2005，38(1):17-24.

［4］Guzman-Rojas L，Rangel R，Salameh A，et al.Cooperative effects of aminopeptidase N(APN)expressed by nonmalignant and cancer cells within the tumor microenvironment［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2012，109(5):1637-1642.

［5］Shousha S，Gadir F，Peston D，et al.CD10immunostaining of bile canaliculi in liver biopsies:change of staining pattern with the development of cirrhosis［J］.Histopathology，2004，45(4):335-342.

［6］ Hembergen Y，Broxtennan UJ，Hanemaaijer R，et al.Soluble aminopeptidase N/CD13in malignant and nonmalignant effusions and intratumoral fluid［J］.Clin Cancer Res，2002，8(12):3747-3754.

［7］Murakami H，Yokoyama A，Kondo K，et al.Circulating aminopeptidase N/CD13is an independent prognostic factor in patientswith non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(24 Pt 1):8674-8679.

［8］Nahye Myong MD.Loss of CD10/NEP expression in the pulmonary carcinogenesis［J］.Cancer Res Treatment，2002，34(1):17-22

［9］Osman I，Yee H，Taneja SS，et al.Neutral endopeptidase protein expression and prognosis in localized prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10(12):4096-4100.

［10］ Wickstr?m M，Larsson R，Nygren P，et al.Aminopeptidase N(APN)as a target for cancer chemotherapy［J］.Cancer Sci，2011，102(3):501-508.