張曉娟，栗紅蕊，崔 巖，王守俊

重組人生長激素 (r-hGH)作為外源性生長激素已廣泛應(yīng)用于臨床，大量研究表明r-hGH在增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成代謝、克服手術(shù)和化療引起的免疫功能下降、加速創(chuàng)口愈合及減少并發(fā)癥等方面有重要臨床意義。r-hGH是否會促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生長已引起臨床注意。本研究選用雌激素受體陽性 (ER+)的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株和雌激素受體陰性 (ER-)的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)，以探討r-hGH對不同類型人乳腺癌細(xì)胞生長的影響及可能涉及的信號通路，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗用品及化學(xué)試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。r-hGH(SAIZEN)購自瑞士Serono公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(ser473)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Erk1/2)、磷酸化Erk1/2抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2濕潤的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 MTT法測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml，接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，行以下處理: (1)以500、1 000、2 000、4 000 μg/L r-hGH作用 48 h;(2)以 4 000 μg/L r-hGH 作用24、48、72、96 h，每組設(shè)6個復(fù)孔，以上均設(shè)未處理對照組。每孔加入 MTT液 (5 mg/ml)20 μl，振蕩后繼續(xù)于37℃、5%CO2環(huán)境中孵育4 h，吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜 (DMSO)200 μl，振蕩5 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度 (A值)。實驗重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期 細(xì)胞以1×105個/孔接種于6孔板，貼壁48 h，用4 000 μg/L r-hGH作用于細(xì)胞，設(shè)立陰性對照組。培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌2次，離心后的細(xì)胞沉淀用70%乙醇2 ml重懸，4℃過夜，50 g/L碘化并啶 (PI)染液染色，4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.5 Western blot檢測Erk1/2、Akt的表達(dá) 細(xì)胞以8×104個/孔接種于6孔板，貼壁48 h，4 000 μg/L r-hGH作用48 h，設(shè)立對照組，提取細(xì)胞總蛋白;BCA法測定蛋白濃度;SDSPAGE膠上每泳道上樣100 μg蛋白，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗 (1∶600)搖床4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3，加HRP標(biāo)記的二抗 (1∶1 000)孵育1 h，洗滌后DAB顯色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以 (x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度r-hGH對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響 與對照組相比，以500、1 000、2 000、4 000 μg/L的r-hGH作用48 h后MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231增殖不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (F值分別為3.156和2.321，P值分別為0.968和0.823，見圖1、2)。

2.2 不同作用時間r-hGH對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞生長影響 與對照組相比，以4 000 μg/L r-hGH作用24、48、72、96 h后MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (F值分別為19.032和1.982，P值分別為0.321和0.076，見圖3、4)。

圖1 不同濃度r-hGH對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 (n=12)Figure 1 Comparison of absorbance in MCF-7 cells with different concentration of r-hGH

圖2 不同濃度r-hGH對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響(n=12)Figure 2 Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells with different concentration of r-hGH

圖3 4 000 μg/L r-hGH作用不同時間時MCF-7細(xì)胞A值的比較(n=12)Figure 3 Comparison of absorbance in MCF-7 cells with different time of r-hGH

圖4 4 000 μg/L r-hGH作用不同時間時MDA-MB-231細(xì)胞A值的比較 (n=12)Figure 4 Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells with different time of r-hGH

2.3 流式細(xì)胞術(shù)測定r-hGH對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，兩組各期細(xì)胞間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1、2)。

2.4 Western blot法測定胰島素作用MCF-7細(xì)胞48 h Erk1/2和Akt表達(dá)情況 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，Erk1/2和Akt磷酸化程度與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表3、4，圖5、6)。

表1 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7細(xì)胞48 h后兩組細(xì)胞周期結(jié)果(x ±s，%)Table 1 Effect of r-hGH on cell cycle of MCF-7 cells between two groups

表2 以4 000 μg/L r-hGH作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后兩組細(xì)胞周期結(jié)果 (x ±s，%)Table 2 Effect of r-hGH on cell cycle of MDA-MB-231 cells between two groups

表3 r-hGH作用MCF-7細(xì)胞后兩組Erk1/2和Akt磷酸化程度比較(x ±s，%)Table 3 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MCF-7 cells after treated with r-hGH

表4 r-hGH作用MDA-MB-231細(xì)胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比較(x ±s，%)Table 4 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MDA-MB-231 cells after treated with r-hGH

圖5 r-hGH作用MCF-7細(xì)胞后Erk1/2和Akt及其磷酸化蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of Akt，P-Akt，Erk1/2 and P-Erk1/2 in MCF-7 cells after treated with r-hGH

圖6 r-hGH作用MDA-MB-231細(xì)胞后Erk1/2和Akt及其磷酸化蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of Akt，P-Akt，Erk1/2 and P-Erk1/2 in MDAMB-231 cells after treated with r-hGH

3 討論

有研究表明，r-hGH可以通過作用于肝臟細(xì)胞膜上生長激素受體 (GHR)產(chǎn)生生長介素如胰島素樣生長因子-1(IGF-1)而促進(jìn)全身組織細(xì)胞的生長和增殖［1-2］，而生長激素的生物效應(yīng)絕大部分是通過IGF1介導(dǎo)發(fā)揮的，Mathews等［3］發(fā)現(xiàn)許多組織細(xì)胞內(nèi) (如骨骼系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、肝臟、腎臟等)有GHR的存在或GHR mRNA的表達(dá)。r-hGH是否會促進(jìn)腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的問題。大量研究證實，IGF-1與受體結(jié)合后通過絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK)途徑和磷脂酰肌醇3激酶(P13K)途徑促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活及遷移，并抑制細(xì)胞凋亡［4］。對腫瘤細(xì)胞而言，IGF-1是很強(qiáng)的絲裂原，介導(dǎo)GH的促生長作用，與人體多種腫瘤的發(fā)生有一定關(guān)系［5-6］。

由于乳腺癌死亡者占女性腫瘤死亡的14%［7］，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命。乳腺癌患者能否應(yīng)用外源性GH，延緩機(jī)體總蛋白的丟失，改善營養(yǎng)，增進(jìn)免疫功能，減少病死率?為了觀察r-hGH對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，考慮不同類型的乳腺癌細(xì)胞中GHR或IGF-1R表達(dá)不同［8］，可能會使r-hGH對其生長的影響也不同，本實驗選用ER+的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株和ER-的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株，采用r-hGH以不同濃度和時間作用于兩種細(xì)胞，以500、1 000、2 000、4 000 μg/L r-hGH 作用 48 h 或 4 000 μg/L r-hGH 作用24、48、72、96 h后，兩種細(xì)胞的增殖程度間無明顯差異;為了進(jìn)一步提高結(jié)果的可靠性，以4 000 μg/L r-hGH作用48 h，用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期變化較對照組無明顯差異;接著對Erk1/2和Akt磷酸化程度檢測，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中r-hGH組Erk1/2和Akt磷酸化程度較對照組無明顯差異，提示IGF-1R和GHR下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt信號通路未被激活。

本研究證實r-hGH在體外無促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長的作用，Erk1/2和Akt的磷酸化程度無明顯升高;同時廖清華等［9］報道r-hGH能增強(qiáng)5-氟脲嘧啶對人乳腺癌細(xì)胞的化療效果。這些均為腫瘤患者術(shù)后應(yīng)用r-hGH進(jìn)行代謝調(diào)理和改善不能手術(shù)的中晚期腫瘤患者的惡病質(zhì)及降低化療毒副作用提供了一定的實驗依據(jù)。但由于本實驗為體外細(xì)胞實驗，可能在GHR的分布、IGF-1的多因素調(diào)節(jié)、癌細(xì)胞生長環(huán)境等方面與體內(nèi)存在差別。因此，需要體內(nèi)實驗即動物模型進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

1 蘇成安.重組人生長激素治療青春期前特發(fā)性矮小癥50例療效分析［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，16(8):1051-1053.

2 段艷峰.河南安陽地區(qū)重組人生長激素治療少年兒童特發(fā)性矮小癥療效分析［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(11):3857.

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4 彭珊璐，馮國祝，王國香，等.新生兒缺氧缺血性腦病血清胰島素樣生長因子-1測定的意義［J］.實用心腦肺血管病雜志，2012，20(4):601.

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9 廖清華，吳向華，陸云飛，等.重組人生長激素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞周期作用的實驗研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，28(4):492-495.