徐明昊，張 悅，孫明華，李恩澤，朱志圖

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (TRAIL)能特異地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，既往研究認(rèn)為腸癌細(xì)胞對TRAIL不敏感［1］;近年研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路的活化可能與腸癌細(xì)胞的敏感性有關(guān)［2-3］。奧沙利鉑 (L-OHP)是第三代鉑類化療藥物，目前已廣泛應(yīng)用于消化道腫瘤的治療，尤其是結(jié)腸癌的一線治療。本研究通過亞毒性劑量奧沙利鉑抑制PI3K/Akt通路以增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞凋亡的敏感性，探討其作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)惠贈;重組人TRAIL購于美國Cytolab/Peprotech Asia公司;奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。碘化丙啶 (PI)、甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、RPMI 1640培養(yǎng)基、RNAse購于Sigma公司;胎牛血清購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所;兔抗人p-Akt、兔抗人Akt、兔抗人Caspase-3及鼠抗人actin抗體購自Santa Cruz公司;羊抗兔和羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長于含10%滅活胎牛血清、青霉素 (100 U/ml)及鏈霉素 (100 mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖率 采用MTT法進(jìn)行檢測，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為3×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中?？瞻讓φ战M加入RPMI 1640培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μl。對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入 MTT液20 μl，到預(yù)定時間后加入二甲基亞砜 (DMSO)液200 μl;TRAIL單藥組加入25、50、100、200、400 ng/ml的TRAIL繼續(xù)培養(yǎng)24 h;奧沙利鉑單藥組加入10、20、40、80 μg/ml奧沙利鉑繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h;聯(lián)合用藥組加入100 ng/ml TRAIL和40 μg/ml奧沙利鉑繼續(xù)培養(yǎng)24 h;各組培養(yǎng)完成后振蕩，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm處各孔吸光度值，各組實驗重復(fù)3次取平均值。計算細(xì)胞增殖率和藥物抑制細(xì)胞增殖50%的濃度 (IC50)。細(xì)胞增殖率 (%)=(處理組平均吸光度值-空白對照組平均吸光度值)/(對照組平均吸光度值-空白對照組平均吸光度值)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，分別收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，冷磷酸鹽緩沖液 (PBS緩沖液)洗滌，加入70%冷乙醇4℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min，加入終濃度為10 mg/ml的PI，避光反應(yīng)30 min后進(jìn)行檢測。采用Cell Quest法計算各期細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白定量 采用蛋白印跡法 (Western blot)檢測各組細(xì)胞蛋白變化，分別收集各組細(xì)胞，冷PBS緩沖液洗滌2次后加入1%Triton裂解液〔1%Triton X-100，50 mmol/L Tris-Cl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，100 mmol/L氟化鈉 (NaF)，1 mmol/L釩酸鈉(Na3VO4)，1 mmol/L苯甲基磷酰氟 (PMSF)，2 μg/ml aprotinin〕，冰上裂解30 min，之后高速離心 (15 000 r/min)30 min，取上清液，Lowry法進(jìn)行蛋白定量。將樣品與3×樣品緩沖液混合后煮沸5 min，于10%SDS-聚丙烯凝膠中電泳，之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗p-Akt、Akt、Caspase-3及actin，4℃孵育過夜。TBST〔10 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween20〕洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min，TBST沖洗，采用ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)成像并分析處理。

1.6 細(xì)胞形態(tài) 采用瑞氏-吉姆薩染色法，將細(xì)胞種于6孔板中，調(diào)整濃度為2.5×104/孔，培養(yǎng)箱內(nèi)過夜后收集各組細(xì)胞，2 000 r/min離心機(jī)甩片3 min制成細(xì)胞涂片，瑞氏-吉姆薩染液 (Sigma)染色，15 min后流水沖洗，干燥后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以 (x±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率 TRAIL單藥組24 h時細(xì)胞增殖率分別為(108.8±6.4)%、 (113.2±12.1)%、 (101.5±5.8)%、(96.8±5.0)%、(90.2±7.2)%，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (對照組細(xì)胞增殖率均為100%，t值分別為1.231、1.385、0.074、0.998、1.976，P ＞0.05，見圖 1A)。奧沙利鉑單藥組24、48、72 h時 IC50分別為 (44.3±7.6)ng/ml、(22.3 ±6.1)ng/ml、 (9.8 ±4.5)ng/ml，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (對照組IC50均為0，t值分別為10.096、6.332、3.772，P＜0.05，見圖1B)。聯(lián)合用藥組24 h時細(xì)胞增殖率為 (30.6±2.7)%，40 μg/ml奧沙利鉑單藥組為 (48.4±5.2)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=9.607，P＜0.05，見圖1C)。

2.2 細(xì)胞凋亡率及蛋白定量 對照組細(xì)胞凋亡率為 (0.9±2.7)%，100 ng/ml TRAIL組為 (2.5±2.1)%，40 μg/ml奧沙利鉑組為 (9.6±1.9)%，聯(lián)合用藥組為 (23.5±3.5)%(見圖2A)。100 ng/ml TRAIL組細(xì)胞凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=0.956，P＞0.05);40 μg/ml奧沙利鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (t值分別為4.971和8.856，P＜0.05)。

100 ng/ml TRAIL組1、3、6、12、24 h時 p-Akt活化性逐漸增強(qiáng)，于6 h和12 h時達(dá)到高峰，24 h時開始減弱 (見圖2B)，沒有觀察到活化的Caspase-3(見圖2C);40 μg/ml奧沙利鉑組和聯(lián)合用藥組p-Akt活化性被明顯抑制，可以觀察到活化的Caspase-3(見圖2C)。

圖1 TRAIL和奧沙利鉑對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖率的影響Figure 1 Effects on cell proliferation rate of colon cancer RKO treated by TRAIL and oxaliplatin

圖2 TRAIL和奧沙利鉑對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響Figure 2 Effects on PI3K/Akt pathway of colon cancer RKO treated by TRAIL and oxaliplatin

圖3 奧沙利鉑作用結(jié)腸癌RKO細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 (瑞氏-吉姆薩染色，×200)Figure 3 Effects on cell morphology of colon cancer RKO treated by oxaliplatin

2.3 細(xì)胞形態(tài) 對照組細(xì)胞形態(tài)正常 (見圖3A)，40 μg/ml奧沙利鉑組可見典型的凋亡小體 (見圖3B)。

3 討論

結(jié)腸癌是世界第3常見惡性腫瘤［4-5］，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，雖然結(jié)腸癌的外科治療已取得巨大進(jìn)步，但因早期診斷率不高，多數(shù)患者就診時已屬晚期。第三代化療新藥和分子靶向藥物的應(yīng)用可顯著提高結(jié)腸癌患者的生存期，但其5年生存率仍不能令人滿意，究其原因，可能是腫瘤患者異質(zhì)性及化療藥物耐藥而導(dǎo)致化療失敗。因此，尋找新型抗腫瘤藥物已成為國內(nèi)外研究熱點。

目前，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的研究熱點之一，而新近發(fā)現(xiàn)的TRAIL可不影響正常細(xì)胞的生長與分化，選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［6-7］，在腫瘤的靶向治療中具有良好的應(yīng)用前景［8］。但部分體外實驗研究顯示，腫瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡作用不敏感甚至完全耐受［9-10］，而獲得性耐藥嚴(yán)重妨礙著其臨床應(yīng)用［11］。本實驗研究結(jié)果顯示，采用MTT法檢測的不同濃度TRAIL作用于結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的細(xì)胞抑制率與對照組比較，均無明顯差異，表明TRAIL對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞不敏感。如何有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性就成為首要解決的問題。

有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路高度活化是結(jié)腸癌細(xì)胞對TRAIL不敏感的重要原因［12］。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，通路活化可以抑制癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實驗研究蛋白定量結(jié)果提示，TRAIL參與結(jié)腸癌RKO細(xì)胞PI3K/Akt的通路活化，可導(dǎo)致結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對TRAIL不敏感。研究表明，紫杉醇、順鉑等化療藥物可增強(qiáng)TRAIL的敏感性［13-15］。奧沙利鉑作為繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑族金屬抗腫瘤藥物，能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞PI3K/Akt通路活化［16-17］，PI3K/Akt通路可能是奧沙利鉑的作用靶點。本研究結(jié)果顯示，40 μg/ml奧沙利鉑作用結(jié)腸癌RKO細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率為 (9.6±1.9)%，明顯高于對照組，且抑制了p-Akt活化性，可以觀察到活化的Caspase-3。聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率提到 (23.5±3.5)%，且同樣抑制了p-Akt活化性，可以觀察到活化的Caspase-3，且其作用較40 μg/ml奧沙利鉑單藥組略有增強(qiáng)，提示奧沙利鉑可引起結(jié)腸癌RKO細(xì)胞凋亡，并通過抑制Akt的活化而提高結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對TRAIL的敏感性。

綜上所述，奧沙利鉑可通過抑制PI3K/Akt通路活化而增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞凋亡的敏感性，提高結(jié)腸癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性，為結(jié)腸癌的靶向治療提供了新的思路。

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