蘭索拉唑抑制幽門(mén)螺桿菌誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞表達(dá)COX-2

魯君艷 張艷 伍海英 李翔 劉勝

幽門(mén)螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)是外形呈螺旋狀的一種微需氧革蘭陰性桿菌。是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的重要病因[1－2]。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸形成前列腺素的關(guān)鍵酶。其中，COX-2在生理狀態(tài)時(shí)機(jī)體細(xì)胞很少表達(dá)或表達(dá)缺如。當(dāng)細(xì)胞受到諸如炎癥、損傷、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、炎癥因子、腫瘤誘導(dǎo)劑及紫外線(xiàn)照射等理化因素刺激時(shí)，COX-2 迅速合成，表達(dá)增加。其產(chǎn)物PGE2作為一種較強(qiáng)的細(xì)胞免疫抑制劑，能抑制免疫系統(tǒng)的監(jiān)管作用，有利于癌細(xì)胞的免疫逃逸。同時(shí)，PGE2本身還具有抑制胃腸道上皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其增生的作用。并參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程。因此，適當(dāng)抑制該酶的表達(dá)對(duì)于治療Hp相關(guān)性胃部疾病應(yīng)該是有益的[3－4]。蘭索拉唑（lansoprazole，LPZ）是由日本武田公司開(kāi)發(fā)的新一代質(zhì)子泵抑制劑，近年研究顯示，LPZ除了具有抗酸作用外，還有一定的抗炎效應(yīng)[5]。如上調(diào)血紅素氧合酶1的表達(dá)，抑制NF-κB的激活，最終抑制Hp誘導(dǎo)的IL-8產(chǎn)生以及中性粒細(xì)胞遷移從而降低炎癥反應(yīng)程度[6]。此外，LPZ也能有效降低吲哚美辛誘導(dǎo)的腸炎[7]。因此，本研究擬采用胃上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS為研究對(duì)象，采用Hp感染后，觀(guān)察LPZ對(duì)COX-2 表達(dá)及PGE2產(chǎn)生的影響。

1 資料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 COX-2鼠抗人多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品, 抗人HRP標(biāo)記兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。蘭索拉唑購(gòu)自日本武田藥品有限公司（Takeda Pharmaceuticals）。青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自華美生物公司。Hp為本研究所保存（ATCC編號(hào)：700392）；胃上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS購(gòu)自ATCC（編號(hào)：CRL-1739）。

1.2 HP的培養(yǎng)及菌液制備 取含Vancomycin(10mg/L)、Amphotericin B(10 mg/L)、Polymyxin B(2500U/L)、TMP(5 mg/L)和 7%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平板分區(qū)劃線(xiàn)，微需氧環(huán)境（10% CO2，5% O2，85% N2）37℃，培養(yǎng) 48h。取單菌落進(jìn)行生化反應(yīng)、革蘭染色和PCR擴(kuò)增鑒定，確定為陽(yáng)性后，用滅菌的生理鹽水將Hp從血瓊脂平板上洗下，然后調(diào)整菌液濃度至1×109CFU/mL。

1.3 AGS細(xì)胞培養(yǎng)與感染 AGS細(xì)胞用含 10%胎牛血清在RPMI-1640 培養(yǎng)基中于5% CO2，37℃下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（僅給予0.1% DMSO為對(duì)照）、Hp感染組（用100 MOI的Hp感染24h）和不同濃度蘭索拉唑組（Hp感染前加入不同濃度蘭索拉唑作用3h）。Hp感染結(jié)束后，獲取細(xì)胞用于以下研究

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)AGS細(xì)胞中COX-2 的表達(dá) 細(xì)胞處理結(jié)束后，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA（FUJIFILM）并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物用RNA酶處理。設(shè)計(jì)特異性引物用于檢測(cè)COX-2表達(dá)的定量。其正向引物：5’-ATCTACCCGCCTCACATCCCT-3’ ；反向引物：5’-AGCTGCTCATCATCCCATTCT-3’ 。利用Light-Cycler PCR儀對(duì)COX-2 進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 10s；60℃ 40s，共35個(gè)循環(huán)。同時(shí)采用β-actin為內(nèi)參。數(shù)據(jù)以COX-2/β-actin比值表示。

1.5 Western blot檢測(cè)AGS細(xì)胞中COX-2 表達(dá) 6孔板中細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后，加入細(xì)胞裂解液裂解30min，4℃ 12000g離心15min，上清即為細(xì)胞總蛋白。裂解液中的蛋白用Bradford試劑在分光光度計(jì)中測(cè)定OD 595處吸光度。50～70μg總蛋白在5%～10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%無(wú)脂牛奶封閉后，分別用孵育一抗，二抗，ECL發(fā)光，顯影。

1.6 PGE2檢測(cè) 收集感染后24孔板中細(xì)胞上清液，按照ELASA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)PGE2水平。即100μL細(xì)胞上清液加入到每個(gè)捕獲抗體包被的微孔板中，室溫孵育2h。洗板后，加入

100μL檢測(cè)抗體，室溫繼續(xù)孵育2h。隨后棄混合物，每孔加入

100μL streptavidin-HRP，室溫避光孵育20min。最后，每孔加入100μL底物，室溫避光孵育20min，然后加入50μL終止液，分光光度計(jì)檢測(cè)450nm處OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘭索拉唑?qū)p感染AGS細(xì)胞后COX-2 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，Hp未感染前AGS細(xì)胞COX-2 表達(dá)很低。Hp感染后其mRNA水平顯著增高。而AGS細(xì)胞預(yù)先經(jīng)30～100μmol/L LPZ處理后，COX-2 mRNA水平有所降低，見(jiàn)圖1。

圖1 蘭索拉唑?qū)p感染AGS細(xì)胞后COX-2 mRNA表達(dá)的影響

2.2 蘭索拉唑?qū)p感染AGS細(xì)胞后COX-2 蛋白表達(dá)的影響 Western blot顯示，AGS細(xì)胞中COX-2 表達(dá)很低。Hp感染能使其表達(dá)水平增加，而不同濃度LPZ處理后能抑制該效應(yīng)，見(jiàn)圖2。

圖2 LPZ對(duì)Hp誘導(dǎo)AGS細(xì)胞表達(dá)COX-2 蛋白的影響

2.3 蘭索拉唑?qū)p誘導(dǎo)AGS細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響 基礎(chǔ)狀態(tài)下AGS細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生PGE2。100 MOI Hp感染后，PGE2含量達(dá)（76±6.5）pg/μg protein。而AGS細(xì)胞若用 100μmol/L LPZ預(yù)孵育 2h，可顯著降低PGE2含量，見(jiàn)圖3。

圖3 蘭索拉唑?qū)p誘導(dǎo)AGS細(xì)胞產(chǎn)生PGE 2的影響

3 討論

雖然機(jī)體對(duì)于Hp感染能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答，但對(duì)清除Hp感染依然有限，因此，一旦感染Hp，將長(zhǎng)時(shí)間維持在持續(xù)感染狀態(tài)。Hp感染引起的炎癥反應(yīng)是Hp的重要致病因素之一。有研究顯示，有效控制Hp感染引起的炎癥反應(yīng)能在一定程度上降低消化系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生。在炎癥與癌癥的發(fā)生過(guò)程中，COX-2 在其中起重要作用，COX-2 蛋白的過(guò)量表達(dá)是胃炎和粘膜損傷的重要機(jī)制，也是胃腫瘤發(fā)生的早期診斷標(biāo)志。除了COX-2，PG也與各種胃腸道疾病密切相關(guān)。COX-2 在炎癥部位被快速誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生大量的炎癥性PG和其它炎癥介導(dǎo)物如細(xì)胞因子和蛋白酶類(lèi)，引起炎癥反應(yīng)。COX-2產(chǎn)生的大量炎癥性PG可引起胃黏膜的損傷。PGE2作為一種較強(qiáng)的細(xì)胞免疫抑制劑，本身還具有抑制胃腸道上皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其增生的作用。PGE2刺激bcl-2蛋白表達(dá)，bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增殖和凋亡失衡，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。由于COX-2 和PG是預(yù)防癌癥和各種炎性相關(guān)疾病的的重要靶點(diǎn)，因此，抑制其過(guò)度表達(dá)除了能減輕局部炎癥反應(yīng)外，對(duì)腫瘤的防治也具有重要的意義[8]。

LPZ是一種第二代質(zhì)子泵抑制劑。對(duì)由組胺、胃泌素和氨甲酰甲基膽堿刺激引起的胃酸分泌均有強(qiáng)力抑制作用，并具有顯著的胃蛋白酶分泌抑制作用。此外，LPZ抗菌活性與檸檬酸鉍相似，而抗菌力為奧美拉唑的4倍。近年的研究證實(shí)，LPZ能抑制小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-8、IL-1 β和TNF-α，同時(shí)也能抑制ERK 1/2信號(hào)通路的活性[9－10]。這表明LPZ除了其固有的抗酸活性外，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)也可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。迄今為止，有關(guān)質(zhì)子泵抑制劑對(duì)Hp感染后胃上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)方面的實(shí)驗(yàn)還很少，目前尚很難確定其在炎癥反應(yīng)中的作用地位。

本研究證明，LPZ能在蛋白和mRNA水平抑制Hp感染后胃上皮細(xì)胞表達(dá)COX-2 并產(chǎn)生PG。由于Hp感染誘導(dǎo)的COX-2 的過(guò)度表達(dá)是胃癌和各種炎性疾病發(fā)生的重要因素，因此，LPZ對(duì)治療帶來(lái)的臨床益處可能遠(yuǎn)超出其抗酸作用所產(chǎn)生的效果，它在抗酸分泌的同時(shí)能有效改善Hp感染后的炎癥反應(yīng)，最終發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用。因此，我們可通過(guò)該效應(yīng)抑制COX-2表達(dá)或減低此酶的活性來(lái)抑制大量PG的產(chǎn)生，從而治療Hp相關(guān)性胃黏膜疾病。

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