肖亞莉，劉建龍，李雪松，余磊，滕巧泱，閆麗萍，李國(guó)新，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海，200241）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus, DTMUV）引起的一種傳染病，該病于2010年春季首先在我國(guó)的上海市、浙江省、江蘇省等地發(fā)生，繼而傳播到全國(guó)大多數(shù)養(yǎng)鴨地區(qū)[1,2]。病鴨主要表現(xiàn)為高熱、運(yùn)動(dòng)障礙、食欲下降甚至廢絕，產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋下降甚至停止，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，死亡率可達(dá)5%～10%[1,2]。該病傳播迅速、傳播范圍廣，給我國(guó)養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，還沒(méi)有商品化的疫苗來(lái)預(yù)防鴨坦布蘇病毒病。

DTMUV屬于黃病毒科（Flaviviridae），黃病毒屬（flavivirus），恩塔亞病毒群[1,2]。黃病毒的E蛋白包含許多與宿主嗜性、宿主細(xì)胞膜融合及宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合相關(guān)的抗原位點(diǎn)[3-5]。對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究對(duì)于理解該病毒的宿主適應(yīng)性、病毒的致病機(jī)制、亞單位疫苗的研發(fā)以及血清學(xué)診斷方法的建立等具有重要意義。

不同物種細(xì)胞在蛋白翻譯過(guò)程中與病毒基因所編碼的蛋白氨基酸密碼子的使用頻率之間存在差異，研究表明密碼子優(yōu)化能顯著提高蛋白的表達(dá)水平[6]。本研究將DTMUV病毒E基因按照昆蟲(chóng)細(xì)胞偏嗜性密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了含有DTMUVE基因的重組桿狀病毒，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)了E蛋白，為進(jìn)一步研究鴨坦布蘇病毒E蛋白的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細(xì)胞與菌株E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備；E.coliDH10BAC感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞Sf9（spodoptera frugiperda）由上海獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 載體與質(zhì)粒 pFastBacHT 載體購(gòu)自 Invitrogen公司。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Polymerase、T4 DNA ligase、LATaq、dNTP 購(gòu)自 TaKaRa寶生物工程（大連）公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；柱式膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜公司；SF-900Ⅱ昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基、Grace's 培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Reagent 購(gòu)自 Invitrogen 公司；胎牛血清購(gòu)自 Gibco；SuperSignal West Pico 化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自Pierce公司。

1.1.4 檢測(cè)試驗(yàn)所用抗體 具有中和活性的抗DTMUV E蛋白的單克隆抗體和抗DTMUV的鴨陽(yáng)性血清由上海獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室制備并保存[7]；抗His單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG購(gòu)自KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 DTMUVE基因的優(yōu)化與合成 將DTMUV的E基因全部的密碼子按照昆蟲(chóng)細(xì)胞所偏嗜的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并將該基因兩端引入BamH I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的基因由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，命名為optiE。

1.2.2 含有目的基因的重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將含有優(yōu)化基因optiE的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III進(jìn)行消化，與經(jīng)相同酶消化的pFastBacHT載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取的質(zhì)粒用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定。將篩選到的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pFastBac-optiE。

1.2.3 含有目的基因的重組桿粒的構(gòu)建與鑒定 將供體質(zhì)粒pFastBac-optiE轉(zhuǎn)化到含有Bacmid和helper質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選，挑取白色單個(gè)克隆，再次劃線于新鮮LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取白色單個(gè)克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取DNA，命名為rBacmid-optiE，使用優(yōu)化的E基因的特異性引物（上游引物F:5'-CTCGGATCCTGTTCAGCTG-3'；下游引物R:5'-AGCAAGCTTTTACACGTTCA-3'） 進(jìn) 行 PCR 鑒定，退火溫度為55℃，延伸2 min，同時(shí)使用M13引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 重組桿狀病毒的獲得 按照Invitrogen公司Bacto-Bac Baculovirus Expression System 技術(shù)手冊(cè)使用Cellfectin reagent將rBacmid-optiE轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27℃培養(yǎng) 4～5 d，直到 70%～80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收獲培養(yǎng)上清和細(xì)胞，300×g離心 15 min，上清即為原代毒種 ( P1 代 ) ，4℃避光保存?zhèn)溆?。?P1 代毒種在Sf 9昆蟲(chóng)細(xì)胞上擴(kuò)大培養(yǎng)1次后即為 P2 代毒種，滴定病毒滴度，并將病毒分裝后，保存于4℃或-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組桿狀病毒滴度的測(cè)定 將培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔106個(gè)細(xì)胞，27℃孵育1 h，棄去培養(yǎng)液。將P2代重組桿狀病毒用新鮮的SF-900 ⅡSFM 培養(yǎng)液進(jìn)行10倍比稀釋后，接種于處理過(guò)的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于27℃孵育1 h，棄去培養(yǎng)液，加入2 mL含有1%低熔點(diǎn)瓊脂的SF-900（1.3×）的斑點(diǎn)培養(yǎng)基覆蓋Sf9細(xì)胞，室溫放置20 min，凝固后移入培養(yǎng)箱，7 d 后用 1 mg/mL 的中性紅溶液覆蓋，室溫孵育2 h，移去多余液體，觀察蝕斑，計(jì)算病毒滴度。

1.2.6 間接免疫熒光鑒定目的蛋白的表達(dá) 將Sf9細(xì)胞鋪于六孔細(xì)胞板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將獲得P2代重組桿狀病毒接種于細(xì)胞，27℃培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷的PBS（PH=7.4）洗滌3次，然后用4℃預(yù)冷的丙酮-甲醛（1：1）固定液于-20℃固定5 min，PBS洗滌3次，自然干燥；加入1000倍稀釋的抗DTMUV E 蛋白的單克隆抗體，37℃作用 1 h；用PBS洗滌3次后，加入100倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃作用1 h；用PBS洗滌5次，自然干燥；熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，同時(shí)用未感染的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.2.7 Western blot 鑒定目的蛋白的表達(dá) 在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，接種P2代重組桿狀病毒，27℃ 培養(yǎng) 72 h 后收獲細(xì)胞，離心去上清。將收獲的樣品用樣品緩沖液重懸后，煮沸5 min， 用12%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，用5%的脫脂乳室溫封閉2 h。然后，相同樣品分三組，第1組加入1000倍稀釋的抗His標(biāo)簽的單克隆抗體，第2組加入1000倍稀釋的抗DTMUV E蛋白的單克隆抗體，第3組加入400倍稀釋的抗DTMUV的鴨陽(yáng)性血清，室溫孵育2 h。用TBST洗滌3次，分別加入5000倍稀釋的羊抗鼠IgG和1000倍稀釋的羊抗鴨IgG，室溫孵育1h，用TBST洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行曝光顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pFastBac-optiE的鑒定獲得的重組質(zhì)粒pFastBac-optiE用BamH I和Hind III進(jìn)行消化后，得到與預(yù)期大小相符的片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果也表明，該質(zhì)粒中含有的目的基因片段與優(yōu)化后的序列完全一致，上述結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的載體是正確的，可用于隨后的試驗(yàn)。

2.2 重組質(zhì)粒rBacmid-optiE的鑒定以提取的重組質(zhì)粒DNA為模板，用優(yōu)化的E基因的特異性引物和M13引物分別進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示，以優(yōu)化的E基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，在1000～2000 bp之間有一條特異性的條帶，以M13引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，在2500～5000 bp之間有一條特異性的條帶，都與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

圖1 pFastBac-optiE質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Restrictive endonucleas analysis of pFastBac-optiE

圖2 重組質(zhì)粒rBacmid-optiE的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of rBacmid-optiE

2.3 間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)將獲得的P2代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，用抗DTMUV E蛋白的單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，P2代病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)比較強(qiáng)的熒光，而未感染病毒的細(xì)胞沒(méi)有熒光信號(hào)，表明DTMUVE基因編碼蛋白在Sf9細(xì)胞中得到了表達(dá)（圖3）。

圖3 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)Fig.3 Identifi cation of E protein expression in Sf9 cells by indirect immunofl uorescence assay

2.4 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)將重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，感染后72 h收集細(xì)胞，分別用抗His標(biāo)簽的單克隆抗體、抗DTMUV E蛋白的單克隆抗體和抗DTMUV的鴨陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，在55～70 kDa之間，3種抗體都檢測(cè)到了特異性條帶，與預(yù)期的大小基本一致（圖4），而正常細(xì)胞對(duì)照組，3種抗體都檢測(cè)不到此特異性條帶（結(jié)果未顯示），上述結(jié)果表明，鴨坦布蘇病毒E蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到了表達(dá)。

圖4 Western blot檢測(cè)重組蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of E protein in insect cells

3 討論

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)所表達(dá)的基因能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工，其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性與天然蛋白十分接近，因此，該系統(tǒng)被廣泛用于多種功能蛋白的表達(dá)[8]。密碼子對(duì)于宿主具有偏嗜性，不同宿主密碼子的使用頻率不同，經(jīng)常會(huì)影響異源基因在該宿主中的表達(dá)[6]。本研究在不改變鴨坦布蘇病毒E蛋白氨基酸序列的基礎(chǔ)上對(duì)E基因的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，使其能在昆蟲(chóng)細(xì)胞中更為高效的表達(dá)。本研究中，間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot試驗(yàn)均證實(shí)E蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到了表達(dá)。本研究沒(méi)有設(shè)未優(yōu)化密碼子的E基因的對(duì)照，尚不能證實(shí)密碼子優(yōu)化提高了E蛋白的表達(dá)量，但既然目的蛋白已經(jīng)得到了表達(dá)，這個(gè)問(wèn)題并不顯得那么重要。

2010年以來(lái)，鴨坦布蘇病毒病給我國(guó)養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，尚無(wú)有效的措施來(lái)控制鴨坦布蘇病毒病的發(fā)生，預(yù)防該病的活疫苗和滅活疫苗正在研制中。對(duì)于鴨坦布蘇病毒病的診斷，已經(jīng)建立了幾種有效的檢測(cè)鴨坦布蘇病毒核酸的檢測(cè)方法，如PCR方法[9]、熒光定量PCR方法[10]和RT-LAMP方法[11]等。另外，幾種檢測(cè)鴨坦布蘇病毒病的血清學(xué)方法，如全病毒間接ELISA[12]和利用單克隆抗體建立的阻斷ELISA等也被建立[7]。本研究利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)了鴨坦布蘇病毒E蛋白，為進(jìn)一步研究E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)，也為建立鴨坦布蘇病毒病血清學(xué)診斷方法提供了很好的物質(zhì)材料。

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