草果精油成分鑒定及其抗菌活性研究

孟大威, 李 偉, 王鵬君, 重松正己, 任慧峰, 陸占國,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院/黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076;2.燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,河北秦皇島 066004;3.日本萜化學(xué)(株),日本神戶 658-0031;4.東京海洋大學(xué)海洋環(huán)境學(xué)科,日本東京 108-8477)

草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)為姜科豆蔻屬多年生草本植物,英文名Tsao-ko amomum[1]或者 Amomum tsao-ko[2],簡稱 tsao-ko,可作為中藥材和調(diào)味料,主要分布在我國廣西,云南,貴州和福建[3-4].

關(guān)于草果精油的萃取以及成分的研究如采用水蒸汽蒸餾法[5-6],溶劑萃取法[5],微波[5-6]、超聲波輔助-溶劑萃取法[6-7]所獲得的精油成分進(jìn)行比較.采用水蒸汽蒸餾萃取法萃取產(chǎn)地不同草果,比較精油成分的差異[8-11].還有采用超臨界CO2法進(jìn)行萃取的報(bào)道[12-13].

關(guān)于草果精油功能性研究報(bào)道如仇厚援等[14]用超聲波輔助-有機(jī)溶劑萃取云南文山縣產(chǎn)草果,比較各萃取物對(duì)金黃葡萄球菌和黑曲霉的抑菌效果,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相對(duì)金黃葡萄球菌抑菌能力最強(qiáng).謝小梅等[15]報(bào)道了水蒸汽蒸餾法萃取草果獲得的精油對(duì)桔青霉,黑曲霉,產(chǎn)黃青霉,黑根霉,黃綠青霉,黃曲霉的抗菌活性,發(fā)現(xiàn)草果具有很好的抑菌活性.

國外關(guān)于草果研究的報(bào)道僅有Nguyen等[16]采用水蒸汽蒸餾法萃取越南產(chǎn)草果,以1.4%產(chǎn)率獲得精油,鑒定出21個(gè)成分,主要成分1,8-桉樹腦占30.06%;Yang等[17]采用水蒸氣蒸餾法萃取桂林產(chǎn)草果,以16.9 mL/kg的產(chǎn)率得到精油,解析出占總精油含量97.65%的73個(gè)化學(xué)成分,主要成分1,8-桉樹腦占45.24%,并測定了精油的抗菌活性.Starkenmann等[18]用乙酸乙酯萃取昆明購買的草果,從乙酸乙酯萃取物中分離出來一個(gè)新的單萜化合物并進(jìn)行了合成.

本課題組[19-20]曾用固相微萃取法等研究了草果干果實(shí)釋放出的香氣成分并與精油進(jìn)行了比較;還發(fā)現(xiàn)草果精油具有清除NaNO2活性[21].為了對(duì)上述內(nèi)容進(jìn)行深入研究,本文采用Clevenger法萃取云南產(chǎn)草果得到的精油成分,通過GC-MS分析檢測,采用保留指數(shù)RI(retention index)法解析并于匹配度解析法比較,定量分析主要成分1,8-桉樹腦含量.并選擇與文獻(xiàn)[14],文獻(xiàn)[15],文獻(xiàn)[17]不同的6種菌,即大腸桿菌,白葡萄球菌,枯草芽孢桿菌,青霉,根霉及米曲霉,用于測定草果精油的抗菌活性,為草果精油的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料與儀器

草果產(chǎn)自云南,2010年3月購于哈爾濱香辛料市場.C6～C26正構(gòu)烷烴標(biāo)樣,美國Supelco公司).大腸桿菌、白葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、根霉和米曲霉由哈爾濱商業(yè)大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室提供.牛肉膏、蛋白胨、瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司).1,8桉樹腦(GC純度99.99%,日本萜化學(xué)公司).

6890N/5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司;氣質(zhì)色譜柱為HP-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,美國 Agilent公司;GC-9A型氣相色譜儀,日本島津公司;氣相色譜柱SE-54(30 m ×0.25 mm ×0.4 μm),大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司;LD2X-30KBS型立式高壓滅菌鍋,上海電安醫(yī)療器械廠;DHP-9032型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;DL-CJ-1F型超凈操作臺(tái),哈爾濱儀器五廠;13395HZX型顯微鏡,上海萊卡顯微鏡系統(tǒng)有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Clevenger法的草果精油萃取操作

Clevenger法的草果精油萃取操作參照文獻(xiàn)[20]和文獻(xiàn)[21].

1.2.2 GC-MS分析條件及成分解析

GC-MS分析條件參照文獻(xiàn)[20]和文獻(xiàn)[21].成分解析時(shí),與數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照的解析方法是采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST 98進(jìn)行匹配對(duì)照,取85%以上匹配度數(shù)據(jù).當(dāng)有多個(gè)高于85%匹配度時(shí),選取最高值,同樣匹配度時(shí),選擇匹配度概率較高值,匹配度低于85%者為未知.根據(jù)保留指數(shù)RI解析方法是使用C6～C26正構(gòu)烷烴標(biāo)樣,與精油樣品同樣條件下進(jìn)行GC-MS分析,將所得數(shù)據(jù)經(jīng)AMDIS 32軟件分析得到保留指數(shù)RI,與文獻(xiàn)的RI值[22]越接近準(zhǔn)確度越高.成分相對(duì)含量采用峰面積歸一化法計(jì)算.

1.2.3 1,8-桉樹腦的定量分析

GC分析條件是柱溫在60℃保持1 min,以5℃/min升到150℃,保持1 min,再以20℃/min升到230℃,保持5 min,載氣為N2,進(jìn)樣量1 μL,分流比 60∶1(v/v).

1,8-桉樹腦標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是用無水甲醇配制質(zhì)量濃度為80,60,40,20,10 mg/mL的1,8-桉樹腦標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,并按N2000工作站(杭州大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)單組份5點(diǎn)校正法以峰面積的響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

精油中1,8-桉樹腦的含量測定是將草果精油用甲醇稀釋10倍后,按1.2.3中GC條件分析3次取其平均值,得到稀釋后草果精油中桉樹腦的峰面積響應(yīng),由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得稀釋后的草果精油中桉樹腦濃度,再乘以稀釋倍數(shù)10,即得草果精油中1,8-桉樹腦的質(zhì)量濃度C.

草果精油密度測定和1,8-桉樹腦的定量計(jì)算是草果精油密度按照中國藥典附錄41相對(duì)密度測定法進(jìn)行測定,再用式(1)計(jì)算草果精油中桉樹腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

式(1)中ρ密度是草果精油的絕對(duì)密度,g/mL;C是標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的純草果精油中桉樹腦的質(zhì)量濃度,mg/mL;XA是草果精油中桉樹腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%.

1.2.4 抗菌活性測定

1.2.4.1 培養(yǎng)基的配制

細(xì)菌液體培養(yǎng)基是使用蛋白胨1 g,NaCl 0.5 g,牛肉膏0.5 g,按照常規(guī)方法制備,滅菌待用.

霉菌液體培養(yǎng)基是使用馬鈴薯200 g和葡萄糖20 g,按照常規(guī)方法制備,滅菌待用.

細(xì)菌和霉菌固體培養(yǎng)基是加入1.5%的瓊脂粉于上述各液體培養(yǎng)基,滅菌得到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(霉菌用).

1.2.4.2 液體菌懸液的配制

0.9 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生理鹽水的配制是取9 g氯化鈉用1 000 mL蒸餾水定容后滅菌備用.此生理鹽水用于液體菌懸液的配制.

所有菌種均制備成液體菌懸液,調(diào)整菌落總數(shù)為108～109cfu/mL.細(xì)菌是通過培養(yǎng)時(shí)間來調(diào)整,霉菌則是采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出相應(yīng)的霉菌后,將其制成高濃度孢子懸液,用無菌生理鹽水稀釋法調(diào)整,具體配制方法如下.

細(xì)菌菌懸液的制備是取大腸桿菌、白葡萄球菌、枯草芽孢桿菌種接入細(xì)菌液體培養(yǎng)基中,于37℃下培養(yǎng):大腸桿菌培養(yǎng)14 h、白葡萄球菌14 h、枯草芽孢桿菌22 h,用GB/T 4789.2—2003食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)法測定其菌落總數(shù),用無菌生理鹽水稀釋法調(diào)整至108～109cfu/mL備用.

霉菌菌懸液的制備是將青霉、根霉、米曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基后,于30℃下培養(yǎng)10 d后,在生理鹽水中將菌落刮下,過濾后即得高濃度孢子懸液.用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)霉菌的孢子總數(shù),用無菌生理鹽水稀釋法調(diào)整至108～109cfu/mL備用.

1.2.4.3 抗菌性測定及抑菌率的計(jì)算

向培養(yǎng)皿中加入20 mL融化并冷卻到45～55℃的無菌固體培養(yǎng)基,待其凝固后,用移液器吸取0.3 mL制備好的液體菌懸液注入其中并涂布均勻.取滅菌濾紙片(直徑6.00 mm)放置于培養(yǎng)皿中央,用移液器吸取5 μL的樣品(草果精油或桉樹腦)注入到濾紙片的正中央后,細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h,霉菌30℃培養(yǎng)72 h后,測定抑菌圈直徑.每個(gè)樣品和對(duì)照物同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取其平均值.抑菌率計(jì)算如式(2).

式(2)中G0為空白對(duì)照的菌種生長量,Gi為樣品或?qū)φ瘴锏木N生長量.菌種生長量(mm)=培養(yǎng)基的直徑(mm)-抑菌圈直徑(mm).

實(shí)驗(yàn)抑菌率所有數(shù)據(jù)均用數(shù)據(jù)處理軟件PASW Statistics 18中用鄧肯極差法進(jìn)行ANONA差異性分析處理,數(shù)值用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,用不同的小寫字母表示不同的顯著差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 草果精油成分分析結(jié)果

用GC-MS分析草果精油獲得總離子流譜圖及匹配度法解析結(jié)果參見文獻(xiàn)[20]和文獻(xiàn)[21].共檢測出38個(gè)成分,根據(jù)數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)譜圖匹配度對(duì)照法,解析出占總成分98.40%的32個(gè)成分,精油主要成 分 是 1,8-桉 樹 腦 (40.89%),α-水 芹 烯(9.77%),2-異丙基苯甲醛(6.99%)等.

由于很多植物精油的主要成分是由萜類化合物構(gòu)成,萜類化合物具有異構(gòu)體數(shù)量多,差別較小的特點(diǎn),雖然,用數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照匹配度對(duì)照法解析鑒定植物精油成分具有簡便快速的優(yōu)點(diǎn),但是,在解析時(shí),會(huì)出現(xiàn)幾種萜類化合物同時(shí)都具有很高的匹配度,雖然,通常選擇匹配度概率較高值,但是,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)很難確定的成分,而采用保留指數(shù)RI法,利用與脂肪烴標(biāo)樣保留指數(shù)比較,就可以容易解決此類問題,國外普遍采用此法進(jìn)行復(fù)雜的精油成分分析.

根據(jù)保留指數(shù)RI法解析草果精油的結(jié)果如表1.解析鑒定出占總成分97.14%的30個(gè)成分,與匹配度對(duì)照法比較,二者一致的成分有24個(gè)成分,占總成分的92.81%,從順序看,所鑒定的大部分成分與匹配度法[20-21]基本一致.

匹配度對(duì)照法鑒定出來的莰烯、(+)-4-蒈烯、茚滿-4-甲醛,在RI法中并沒能鑒定出來;匹配度對(duì)照法鑒定出來的2-異丙基苯甲醛、α-甲基肉桂醛、(E)-2-十二烯-1-醛、β-蓽澄茄烯等成分,在 RI法中分別被確定為4-丙基苯甲醛、古巴烯、乙酸(E)-2-癸烯醇酯和大根香葉烯,這是因?yàn)樗鼈冎g結(jié)構(gòu)非常相似的緣故.

2.2 草果精油主成分1,8-桉樹腦含量分析結(jié)果

雖然,采用GC-MS分析可以得到精油各成分相對(duì)分含量,但是,并非真實(shí)的成分質(zhì)量分?jǐn)?shù).本文采用GC面積外標(biāo)法對(duì)草果精油主成分1,8-桉樹腦進(jìn)行定量分析.1,8-桉樹腦標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果如圖1.由圖1可知得到桉樹腦標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5.82×10-5x.其中x為峰面積響應(yīng)值;y為桉樹腦質(zhì)量濃度,mg/mL;R2=0.999 0.

用GC分析草果精油得到1,8-桉樹腦峰面積見表2.由表2可以看出,草果精油峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.75%,小于5%,說明重復(fù)性好,精密度高.

表2中的峰面積平均值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)稀釋后精油中桉樹腦的濃度為44.398 mg/mL,換算后,草果精油中桉樹腦的濃度為443.98 mg/mL,再由測得草果精油的密度為0.924 3 g/mL計(jì)算得到草果精油中的主要成分1,8-桉樹腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.03%,高于GC-MS面積歸一化法(40.89%),即草果精油中1,8-桉樹腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)為48.03%.

2.3 抗菌活性測定結(jié)果與分析

2.3.1 對(duì)細(xì)菌的抗菌活性測定結(jié)果與分析

用草果精油、1,8-桉樹腦分別對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌等3種常見細(xì)菌的抑菌活性進(jìn)行了測定,結(jié)果見圖2,圖3和圖4.

表1 RI法解析草果精油成分Tab.1 Identification results of essential oil components of Amomum tsao-ko

表2 草果精油中1,8-桉樹腦的峰面積及數(shù)據(jù)處理結(jié)果Tab.2 Peak areas of 1,8-cineol in Amomum tsao-ko essential oil and results of data treatment

圖1 1,8-桉樹腦定量分析用標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard carve for quantitative analysis of 1,8-cineol

圖2 對(duì)大腸桿菌的抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity against E.Coli

由圖2,圖3和圖4可見,通過肉眼直觀地可見草果精油對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌以及枯草芽胞桿菌具有明顯的抑菌活性,并形成清晰可見的抑菌圈.

圖3 對(duì)白葡萄球菌的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity against S.Albus

圖4 對(duì)枯草芽胞桿菌的抗菌活性Fig.4 Antibacterial activity against A.oryzae

從抑菌圈直徑大小和抑菌率看抑菌能力由大到小依次是枯草芽孢桿菌(20.5 mm;17.28%±6.38)、白葡萄球菌(17.2 mm;13.33% ±2.07)、大腸桿菌(12.0 mm;7.12% ±1.71).而精油主要成分的1,8-桉樹腦對(duì)3種菌都沒有抑菌活性,也就是精油的抑菌作用并非是其主要成分1,8-桉樹腦而為,推斷是其他成分的綜合作用結(jié)果.抑菌圈平均直徑,抑菌率以及對(duì)抑菌率采用鄧肯極差法進(jìn)行差異性分析等結(jié)果如表3.

表3 草果精油的抑菌活性測定結(jié)果Tab.3 Assaying results of antibacterial activity of essential oil of Amomum tsao-ko and 1,8-cineole

2.3.2 對(duì)霉菌的抗菌性測定結(jié)果和討論

測定了草果精油和1,8-桉樹腦對(duì)青霉,根霉和米曲霉三種常見霉菌的抗菌活性測定結(jié)果如圖5,圖6和圖7.

圖5 對(duì)青霉菌的抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity against Penicillium sp.

圖6 對(duì)根霉的抗菌活性Fig.6 Antibacterial activity against Rhizopus sp.

圖7 對(duì)米曲霉抗菌活性Fig.7 Antibacterial activity against A oryzae.

草果精油對(duì)青霉、根霉和米曲霉顯示明顯的抑菌作用.而1,8-桉樹腦沒有抑制作用.抑菌圈直徑以及抑菌率計(jì)算結(jié)果如表3.

從抑菌圈和抑菌率看精油對(duì)三種霉菌的抑菌能力由大到小依次為米曲霉(23.1 mm)、根霉(16.2 mm)、青霉(13.4 mm);相應(yīng)的抑菌率由大到小依次為米曲霉(20.36% ±4.33)、根霉(12.12% ±1.41)、青霉(8.76% ±2.53).

3 結(jié) 論

本文對(duì)采用Clevenger法萃取草果揮發(fā)性成分獲得的精油進(jìn)行GC-MS分析后,采用RI法進(jìn)行解析,與以往報(bào)道[20-21]的匹配度對(duì)照解析法比較,38個(gè)成分中有24個(gè)成分一致,占總成分的92.81%.用外標(biāo)法定量分析主要成分1,8-桉樹腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.03%,比用 GC-MS的面積歸一化法高7.14%.精油和1,8-桉樹腦的抗菌活性測定結(jié)果顯示,精油具有明顯的抗菌活性.從抑菌圈直徑和抑菌率看,對(duì)3種細(xì)菌的抑菌活性由大到小依次為枯草芽孢桿菌,白葡萄球菌,大腸桿菌;對(duì)3種霉菌的抑菌活性由大到小依次為米曲霉,根霉,青霉.草果精油的主要成分1,8-桉樹腦對(duì)上述6種菌幾乎沒有抗菌活性,明確了草果精油的抗菌活性并不是1,8-桉樹腦作用的結(jié)果,而是其他成分綜合作用的結(jié)果.

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