張正,榮小軍,王印庚,王嵐,廖梅杰,李彬

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071)

一種病毒感染引起半滑舌鰨腹水癥的病理學(xué)觀察

張正,榮小軍,王印庚,王嵐,廖梅杰,李彬

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071)

利用石蠟切片技術(shù)和電鏡技術(shù)對患有腹水癥的半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis Günther主要組織器官進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察與分析。結(jié)果表明:感染腹水癥的半滑舌鰨全身主要的組織器官都發(fā)生了不同程度的病理變化,其中鰭部皮膚出現(xiàn)血紅細(xì)胞浸潤和淤積;鰓小葉上皮細(xì)胞空泡變性,柱狀細(xì)胞發(fā)生炎癥;肝胰臟和腎臟都出現(xiàn)了局灶性的組織壞死和潰爛,組織間充滿空泡變性的細(xì)胞,超微病理觀察發(fā)現(xiàn)大量病毒粒子;心臟的心肌組織出現(xiàn)固縮和局灶性潰爛;膽囊壁漿膜層結(jié)締組織增生,毛細(xì)血管充血;消化道黏膜層和黏膜固有層分離,黏膜固有層成纖維細(xì)胞固縮或水樣變性,致密層變疏松。根據(jù)病理學(xué)研究結(jié)果初步分析認(rèn)為,一種未知病毒可能是半滑舌鰨腹水癥的主要致病原。

半滑舌鰨;魚病;腹水;病毒;組織病理

1 材料與方法

1.1 病魚樣品取樣

患腹水癥的半滑舌鰨病魚樣品取自山東省某半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖廠,患病半滑舌鰨體長為 (20± 5)cm,體質(zhì)量為 (50±10)g。發(fā)病時,病魚普遍表現(xiàn)為不愛攝食、腹腔明顯隆起,日死亡率約為2%。從發(fā)病養(yǎng)殖池中挑取外觀腹水癥狀明顯的病魚放入解剖盤中,現(xiàn)場解剖并剪取鰭、鰓、心臟、肝胰臟、脾、腎、膽囊和消化道等組織器官,將各組織的小塊 (不超過 0.5 cm3)放入 Davidson's AFA固定液中固定,用于組織病理觀察。同時,剪取厚度小于1 mm的各塊病魚組織,放入電鏡固定液中固定,用于超微病理觀察。

Davidson's AFA固定液配方:體積分?jǐn)?shù)為10%的多聚甲醛溶液20 mL,體積分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液10 mL,0.4 mol/L磷酸緩沖液 (pH 7.2)50 mL,4 mol/L NaCl溶液4 mL,1 mol/L CaCl2溶液0.4 mL,蒸餾水15.6 mL,總體積100 mL。

電鏡固定液分為固定液和緩沖液兩種,固定液配方:體積分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛溶液50 mL,NaCl 1.989 g,蒸餾水50 mL,總體積100 mL;緩沖液配方:100 mL溶液中含 NaH2PO45.54 g,NaOH 1.425 g。使用前將固定液和緩沖液按等體積比混合。

1.2 石蠟切片的制備與觀察

將用Davidson's AFA固定液浸泡24 h后的組織塊放入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中,浸泡36 h后制作病理切片。其制作過程經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、染色、封片等步驟。其中,在染色步驟中,依據(jù)組織特性的不同,設(shè)定鰓和鰭組織的蘇木精染色時間為5 min,伊紅染色時間為50 s;肝胰臟、脾臟、腎臟、膽囊和心臟組織的蘇木精染色時間為4 min,伊紅染色時間為1 min;消化道的蘇木精染色時間為4 min,伊紅染色時間為1.5 min。用Nikon ECLIPSE E800光學(xué)顯微鏡對制備好的病理切片進(jìn)行顯微觀察,并用Nikon DS-Fi1數(shù)字?jǐn)z像頭結(jié)合Nikon NIS-Elements圖像分析軟件進(jìn)行拍照和測量。

1.3 電子顯微鏡切片的制備與觀察

綜上所述，隨著媒介融合時代的到來，新聞受眾和新聞生產(chǎn)者之間的界限變得越來越模糊，這一現(xiàn)象的存在不僅僅給新聞編輯帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，同時也是一種機(jī)遇。要想更好地抓住這次機(jī)遇和應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，要求新聞編輯準(zhǔn)確地做好自我定位，不斷提升自身素養(yǎng)，努力成為媒體融合時代中合格且優(yōu)秀的傳媒人才。

將放于電鏡固定液中的組織塊在4℃條件下固定24 h后,用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗3次,每次10 min,再用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定1.5 h。用磷酸緩沖液沖洗后置于梯度乙醇中脫水,再用Epon812包埋劑包埋。使用Ultracut-E型超薄切片機(jī) (Reichert-Jung)制作超薄切片,然后置于銅網(wǎng)上以體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸鉛和檸檬酸鉛雙染色。最后用JEM-1200EX型透射電子顯微鏡觀察超微病理變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1 臨床病變特征

腹水癥是半滑舌鰨養(yǎng)殖過程中最為常見的疾病之一,臨床病變特征明顯,在養(yǎng)殖池中容易發(fā)現(xiàn)。發(fā)病時病魚通常不攝食,活力下降,游泳無力或漂游。從外觀上看,病魚顯著的病變特征是腹腔隆起呈半球狀,打開腹腔后可在腹腔內(nèi)或者消化道中發(fā)現(xiàn)大量無色或淡黃色積液,而消化道中充滿積液的情況更為多見。病情嚴(yán)重時,消化道由于大量積水而變成半透明狀,并且從泄殖孔中凸出。除了非常明顯的體腔積水外,病魚的鰭部也充血發(fā)紅,并有輕度的糜爛 (圖1-A、B)。內(nèi)臟團(tuán)各個器官也有不同程度的病理變化,如肝臟充血、膽囊變色、腎臟異常增大等。腹水癥可感染不同養(yǎng)殖時期的半滑舌鰨,感染率高,傳播迅速,但在臨床上常因各個養(yǎng)殖時期魚體規(guī)格的不同而表現(xiàn)出不同的死亡率。臨床調(diào)查顯示,半滑舌鰨仔稚魚和體長為15 cm以下的苗種感染該病的累積死亡率高達(dá)90%以上。

2.2 顯微病理變化

通過對組織病理切片進(jìn)行顯微和超微病理觀察發(fā)現(xiàn),患腹水癥的半滑舌鰨各個組織器官都出現(xiàn)了不同程度且多樣化的病理變化,表現(xiàn)出多器官病變的病理特征。

鰭部皮膚健康半滑舌鰨的體表皮膚分為明顯的表皮層和真皮層,真皮層又進(jìn)一步細(xì)分為外膜層和疏松層。病魚鰭部的臨床病變特征表現(xiàn)為明顯的組織充血現(xiàn)象 (圖1-A、B),而顯微病理觀察發(fā)現(xiàn)病魚鰭部皮膚的表皮層和真皮層組織中都有大量血紅細(xì)胞浸潤 (圖1-C),病情嚴(yán)重時浸潤的血紅細(xì)胞形成點(diǎn)狀淤積,最終導(dǎo)致皮膚組織中血紅細(xì)胞大面積淤積 (圖1-D)。

鰓患腹水癥的半滑舌鰨鰓絲表現(xiàn)為兩種比較典型的局灶性病理變化。一種病變是鰓小葉的扁平上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的空泡變性,整個細(xì)胞呈水泡狀,細(xì)胞核及細(xì)胞間質(zhì)完全消失 (圖1-E);另一種病變是鰓小葉的柱狀細(xì)胞發(fā)生炎癥變化,細(xì)胞質(zhì)著色加深,使整個鰓小葉組織膨脹似增生狀 (圖1 -F)。但鰓小葉原有的羽毛狀排列結(jié)構(gòu)并未出現(xiàn)明顯破壞,也未見血紅細(xì)胞淤積等循環(huán)系統(tǒng)障礙。

肝胰臟健康半滑舌鰨的胰臟以大小不等的組織塊嵌入到肝組織中,形成肝胰臟。肝細(xì)胞為近似橢圓的多角形細(xì)胞,在蘇木精-伊紅 (H.E)染色后呈現(xiàn)均質(zhì)的空泡樣結(jié)構(gòu)。胰腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的嗜酸性,而細(xì)胞間結(jié)締組織的H.E染色為深紫色,表現(xiàn)出非常強(qiáng)的嗜堿性?；几顾Y病魚胰臟組織發(fā)生固縮并相互解離,腺體間的結(jié)締組織呈現(xiàn)水樣變性,組織變得疏松透明。變性的結(jié)締組織間發(fā)現(xiàn)大量顆粒狀變性細(xì)胞,肝組織間出現(xiàn)血紅細(xì)胞浸潤 (圖1-G)。而病變嚴(yán)重的肝組織可見局灶性的組織壞死和潰爛,潰爛的組織間充滿大量發(fā)生空泡變性的肝細(xì)胞 (圖1-H)。超微病理觀察發(fā)現(xiàn),發(fā)生空泡變性的肝細(xì)胞僅存細(xì)胞壁,胞內(nèi)細(xì)胞器已經(jīng)完全消失,整個細(xì)胞呈空泡樣的圓環(huán)狀(圖1-I)。而在壞死的肝細(xì)胞及肝組織中發(fā)現(xiàn)有大量病毒粒子以及病毒包涵體存在 (圖1-J)。

脾臟健康半滑舌鰨的脾臟可以明顯區(qū)分為紅脾髓區(qū)和白脾髓區(qū),紅脾髓區(qū)一般為血紅細(xì)胞的集中區(qū),而白脾髓區(qū)為淋巴細(xì)胞集中的區(qū)域,兩者在脾臟組織中相嵌而成?；几顾Y的半滑舌鰨脾臟紅脾髓區(qū)的血紅細(xì)胞著色加深 (圖1-K),并呈現(xiàn)黃褐色,與溶血性貧血的病理特征極為相似[10]。而在淋巴細(xì)胞集中的白脾髓區(qū)可以發(fā)現(xiàn)大量已經(jīng)空泡化的淋巴細(xì)胞存在 (圖1-L)。超微病理觀察發(fā)現(xiàn),病變脾臟中紅脾髓區(qū)的血紅細(xì)胞大量死亡,細(xì)胞核固縮,細(xì)胞質(zhì)逐漸崩解消失 (圖1-M)。而發(fā)生空泡變性的淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞器也發(fā)生了崩解,整個細(xì)胞胞內(nèi)結(jié)構(gòu)已經(jīng)雜亂無章,細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大面積的空泡區(qū) (圖1-N)。

圖1 患腹水癥的半滑舌鰨及其鰭部皮膚、鰓絲、肝胰臟和脾臟的病理變化Fig.1 The pathological changes in half-smooth tongue sole,its skin,gill,hepatopancreas,and spleen with ascites symptom

腎臟硬骨魚的腎臟主要由腎小球、腎小管和填充其中的腎間質(zhì)組織構(gòu)成[10]。健康半滑舌鰨的腎間質(zhì)組織致密,腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰,排列有序?；几顾Y病魚的腎臟病變主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)組織局灶性的大面積壞死和崩解,腎間質(zhì)組織幾乎完全消失 (圖2-A),在壞死的組織間發(fā)現(xiàn)血紅細(xì)胞局部淤積和H.E染色呈深紫色的病毒包涵體存在 (圖2-B)。超微病理觀察發(fā)現(xiàn),壞死區(qū)的腎間質(zhì)細(xì)胞中充滿了大量的病毒粒子,原有的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器已經(jīng)完全消失 (圖2-C)。待病毒粒子完全釋放后,整個腎間質(zhì)細(xì)胞同病變的肝細(xì)胞一樣呈現(xiàn)出空泡樣的環(huán)狀結(jié)構(gòu) (圖2-D)。

心臟患腹水癥的半滑舌鰨心臟部分心肌纖維發(fā)生了固縮,心肌纖維之間出現(xiàn)了明顯的空白區(qū)域(圖2-E)。病變嚴(yán)重時,心肌出現(xiàn)了局灶性的組織潰爛,致使原有的心肌三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被完全破壞,壞死的心肌組織間也發(fā)現(xiàn)大量H.E染色呈紫色的炎癥細(xì)胞浸潤 (圖2-F)。

膽囊患腹水癥的半滑舌鰨膽囊壁主要有兩種明顯的病理變化:一是平滑肌層的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,嚴(yán)重時大量血紅細(xì)胞淤積于毛細(xì)血管管腔內(nèi)形成血栓 (圖2-G);二是膽囊壁漿膜層發(fā)生非常明顯的局灶性結(jié)締組織增生,使?jié){膜層局部組織加厚(圖2-H)。

消化道患腹水癥的半滑舌鰨消化道病變明顯的臨床特征是消化道壁變得薄而透明。組織病理觀察發(fā)現(xiàn),病魚消化道的黏膜層和黏膜固有層發(fā)生組織分離,黏膜固有層或出現(xiàn)組織固縮,或組織中成纖維細(xì)胞發(fā)生水樣變性,使整個固有層呈水腫狀態(tài)(圖2-I)。而致密層組織也變得非常疏松,呈現(xiàn)多孔樣,部分區(qū)域出現(xiàn)輕微的潰爛 (圖2-J)。超微病理觀察發(fā)現(xiàn),黏膜固有層成纖維細(xì)胞病變初期細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡,隨后空泡相互連結(jié)成大片的空白區(qū),細(xì)胞質(zhì)基本消失 (圖2-K)。至后期在黏膜固有層中形成了大量空泡區(qū),并逐步造成黏膜層和黏膜固有層解離 (圖2-L)。

3 討論

腹水癥是多種海、淡水經(jīng)濟(jì)魚類人工養(yǎng)殖過程中最易發(fā)生的疾病之一,它以魚體腹腔或消化道腔內(nèi)形成大量無色或黃色積水為主要臨床特征,具有極高的感染率和死亡率,能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,已經(jīng)成為魚類集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)中的普遍性問題。

從臨床癥狀上看,感染腹水癥的不同魚類大多表現(xiàn)出活力下降、攝食減弱、腹部隆起以及內(nèi)臟器官出現(xiàn)不同程度的充血、腫大、發(fā)炎等特征。本研究中感染腹水癥的半滑舌鰨病魚也表現(xiàn)出與之相似的外觀病變特征。不同的是,筆者所解剖的半滑舌鰨病魚腹水大多集中于消化道腔內(nèi)。病變嚴(yán)重時,由于消化道腹水積壓過多,對腹腔壓力增大,因而導(dǎo)致部分消化道脹出泄殖孔,形成更為明顯的臨床病灶,在生產(chǎn)實(shí)踐中更容易識別。

對于養(yǎng)殖魚類腹水癥的發(fā)生原因,國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了廣泛研究。多數(shù)學(xué)者研究認(rèn)為,生物性病原的感染是誘發(fā)魚類腹水癥的主要原因,其中以細(xì)菌感染最為多見。李筠等[11]報道了遲鈍愛德華氏菌可以造成養(yǎng)殖大菱鲆的腹水癥,張偉妮等[12]從患腹水癥的大菱鲆中分離出溶藻弧菌,莫照蘭等[13]從患腹水癥的牙鲆幼魚體內(nèi)分離出燦爛弧菌,王國良等[14]報道了擬態(tài)弧菌可造成黑鯛幼魚的腹水癥,Altinok等[15]報道了假單胞菌感染的虹鱒魚也出現(xiàn)了腹水癥狀。本研究中,通過超微病理觀察,在出現(xiàn)腹水癥狀的半滑舌鰨腎臟和肝臟組織中都發(fā)現(xiàn)了病毒粒子存在,其中腎臟中病毒粒子數(shù)量尤其巨大,這也直接證實(shí)了半滑舌鰨腹水癥很有可能是由病毒引起的。

有關(guān)魚類腹水癥組織病理學(xué)方面的研究報道相對較少。張濤等[16]對患腹水癥的黃顙魚進(jìn)行了組織病理學(xué)研究,結(jié)果顯示病魚的鰓小葉上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、增生和肥大等病理變化,這與筆者觀察到半滑舌鰨病魚鰓小葉上皮細(xì)胞水腫和柱狀細(xì)胞發(fā)生炎癥且鰓小葉似組織增生狀極為相似?；几顾Y的黃顙魚組織器官病變還表現(xiàn)在腎小管和腎間質(zhì)的組織壞死,腎小球正常結(jié)構(gòu)消失,肝細(xì)胞水泡變性和肝組織局灶性壞死[16]。古麗加瑪·買買提等[17]對患腹水癥的羅非魚進(jìn)行了組織病理學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)病魚的各個組織器官也都發(fā)生了不同程度的病變,其中肝臟、腎臟和脾臟的病變最為明顯,出現(xiàn)了組織壞死、充血和炎性細(xì)胞浸潤等嚴(yán)重的病理變化。與以上兩位學(xué)者的研究結(jié)果相比,患腹水癥的半滑舌鰨肝胰臟和腎臟都出現(xiàn)了局灶性的大面積組織壞死和潰爛,大量的肝細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞都發(fā)生了空泡變性,病理變化表現(xiàn)得更為嚴(yán)重。Teruo等[18]對遲鈍愛德華氏菌感染牙鲆導(dǎo)致的腹水癥也進(jìn)行了組織病理學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),病魚牙鲆的肝臟和腎臟中出現(xiàn)了組織膿腫,在部分病魚的心臟、鰓小葉和肌肉中也出現(xiàn)了膿腫,并推測這些膿腫的形成大多是因?yàn)椴≡?xì)菌入侵造成的。而這一病理現(xiàn)象在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)。

與上述研究結(jié)果不同的是,本研究中觀察到感染腹水癥的半滑舌鰨心臟出現(xiàn)諸如心肌固縮和局灶性潰爛等比較嚴(yán)重的病變。心臟是魚類重要的循環(huán)器官,其嚴(yán)重的病變勢必會造成機(jī)能下降。通過病理學(xué)觀察,在病魚的皮膚、肝胰臟、腎臟等組織器官中都發(fā)現(xiàn)了明顯的血紅細(xì)胞浸潤或淤積現(xiàn)象,而脾臟中血紅細(xì)胞也出現(xiàn)了大量死亡。從這些病理現(xiàn)象分析,由于病魚血細(xì)胞的大量流失和心臟組織的病變,患腹水癥的半滑舌鰨一定存在著比較嚴(yán)重的機(jī)體循環(huán)障礙。

圖2 患腹水癥的半滑舌鰨腎臟、心臟、膽囊和消化道的病理變化Fig.2 The pathological changes of kidney,heart,gallbladder,and digestive tract in half-smooth tongue sole with ascites symptom

此外,患腹水癥的半滑舌鰨消化道的病變也是非常明顯的。主要的病理變化包括黏膜層和黏膜固有層發(fā)生組織固縮和分離,黏膜固有層成纖維細(xì)胞水樣變性,局灶性組織潰爛等。消化道是魚類汲取外界營養(yǎng)最主要的器官,健康魚通過消化道黏膜層吸收營養(yǎng)物質(zhì),經(jīng)黏膜固有層的毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)輸送至全身各個器官。而患腹水癥的半滑舌鰨病魚消化道出現(xiàn)這些病變,足以造成魚體吸收障礙,使其正常的新陳代謝受到影響。這也有可能是造成腹水癥病魚不攝食或攝食力減弱的主要原因。

從組織病理學(xué)研究結(jié)果推測,半滑舌鰨的腹水癥極有可能是由病毒感染引起的,而病毒的主要侵染器官是腎臟和肝臟,在其他組織器官中并沒有發(fā)現(xiàn)病毒粒子。然而,病魚全身多個組織器官都出現(xiàn)了不同程度的病變,這必然會導(dǎo)致多器官功能的衰竭,形成循環(huán)和吸收障礙,進(jìn)而使魚體逐漸喪失正常的生理代謝,最終造成病魚死亡。養(yǎng)殖生產(chǎn)中對于該病應(yīng)該以提前預(yù)防為主,經(jīng)常觀察養(yǎng)殖池中魚的生理狀態(tài)變化,分撿活力較弱或攝食不佳的病魚,并及時采取有效的消毒措施和投喂一些能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力的中草藥[19],以降低該病的發(fā)生機(jī)率。

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Histopathology of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis Günther with viral ascites

ZHANG Zheng,RONG Xiao-jun,WANG Yin-geng,WANG Lan,LIAO Mei-jie,LI Bin

(Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China)

The histopathology of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis Günther with viral ascites was studied using paraffin section technique and transmission electron microscopy in order to find out the pathological changes in tissues and organs.The results showed that various lesions were found in most organs of the diseased fish.In comparison with healthy fish,the diseased fish showed the major pathological changes in tissues and organs,including erythrocyte infiltration and accumulation in skin tissues of fin,epithelial cell vacuolar degeneration and pillar cells inflammation of gill filament;focal tissues necrosis and ulcer full of numerous vacuolar degeneration cells in the hepatopancreas and kidney;massive virions occurred in the hepatopancreas and kidney;myocardium tissues pyknosis and focal ulceration in heart;connective tissue of serous membrane hyperplasia and capillaries extensive congestion in gall bladder walls.Lamina propria dissociated from mucosal epithelia,stratum compactum appeared porosity and fibroblasts of lamina propria were hydropic degeneration or pyknosis in the digestive tract.

Cynoglossus semilaevis Günther;fish disease;ascites;virus;histopathology

S941.41

A

2012-09-13

國家科技支撐計劃項(xiàng)目 (2012BAD17B03)

張正 (1979-),男,博士,副研究員。E-mail:zhangzheng@ysfri.ac.cn

王印庚 (1963-),男,博士,研究員。E-mail:wangyg@ysfri.ac.cn

2095-1388(2013)03-0287-06