仿刺參體壁創(chuàng)傷修復(fù)消減文庫的構(gòu)建與分析

秦艷杰,李霞,張慧敏,王雪

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遼寧省海洋生物資源與生境恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

仿刺參體壁創(chuàng)傷修復(fù)消減文庫的構(gòu)建與分析

秦艷杰,李霞,張慧敏,王雪

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遼寧省海洋生物資源與生境恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù) (SSH),構(gòu)建了仿刺參Apostichopus japonicus(體質(zhì)量為65～90 g)正常體壁及創(chuàng)傷修復(fù) (24、48、72、96、120 h后)體壁的消減cDNA文庫,利用PCR和斑點(diǎn)雜交技術(shù)對文庫進(jìn)行篩選,隨機(jī)挑取的768個克隆中發(fā)現(xiàn)292個陽性克隆,對其中信號強(qiáng)度較強(qiáng)的224個陽性克隆進(jìn)行測序,得到208個有效EST序列。經(jīng)BlastX工具對獲得的EST與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,結(jié)果有171個EST序列與數(shù)據(jù)庫中的基因同源 (e≤0.001,相似性＞40%),其中153個為未知基因,18個為已知功能或已命名基因,包括在創(chuàng)傷及修復(fù)的體壁中上調(diào)表達(dá)的β微管蛋白、微管蛋白α-1鏈、肌動蛋白、肌動蛋白ike 7B類似物、細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ、tRNA假尿苷合成酶A、GTP酶、細(xì)胞分裂周期2類似蛋白、有絲分裂原活化蛋白激酶、homeobox蛋白、延伸因子1A、核糖體蛋白L30、核糖體蛋白L17、60S酸性核糖體蛋白P0、26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基、泛素特異性肽酶24、大腸癌血清抗原3、清道夫受體蛋白12等。本研究結(jié)果可為探討刺參體壁再生過程和分子機(jī)理,以及篩選刺參體壁創(chuàng)傷修復(fù)過程中相關(guān)功能基因的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

刺參;體壁;抑制性消減雜交;cDNA文庫;創(chuàng)傷和修復(fù)

再生作為發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容,越來越受到科研工作者的重視。關(guān)于刺參體壁再生的研究,最早集中在對刺參再生體壁的形態(tài)學(xué)描述及常規(guī)組織學(xué)研究[1-4],近年來逐漸開始進(jìn)行分子機(jī)理的探討,如陳秋實(shí)等[5]通過DDRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)刺參表皮再生過程中CD151基因大量表達(dá),說明該基因在刺參的組織損傷修復(fù)反應(yīng)過程中扮演著重要角色。但刺參的再生過程涉及復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,目前零散的研究報(bào)道對于探討刺參體壁再生的分子機(jī)理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression subtractive hybridization,SSH)是一種尋找差異表達(dá)基因十分有效的方法[6-7],廣泛應(yīng)用于分離各種生物在不同生理狀態(tài)下表達(dá)出現(xiàn)差異的基因。用該方法克隆表達(dá)出現(xiàn)差異的基因,假陽性比率低,同時對低豐度基因具有富集作用,而低豐度基因往往在生命活動中起著重要作用[8-10]。本研究中,作者以仿刺參Apostichopus japonicus為試驗(yàn)對象,首次構(gòu)建了仿刺參體壁創(chuàng)傷修復(fù)的正反消減文庫,隨機(jī)挑取部分陽性克隆進(jìn)行測序,通過BlastX對這些EST序列進(jìn)行功能比對分析,旨在為研究刺參體壁創(chuàng)傷和修復(fù)的調(diào)控機(jī)理、作用方式以及分離與再生相關(guān)的基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)仿刺參為1～2齡個體,體質(zhì)量為65～90 g,體長 (麻醉狀態(tài)下)為10～14 cm。于2010年4月取自大連市龍王塘海域,為自然生長的個體。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)仿刺參的處理及創(chuàng)傷試驗(yàn) 試驗(yàn)開始前,將隨機(jī)分組的仿刺參暫養(yǎng)于農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,于10℃下恢復(fù)7 d,然后逐漸升溫,飼養(yǎng)用水為沙濾海水,鹽度為30～32,每天定時半量換水,投喂人工配合飼料。

挑選個體適中、生長狀況良好的25頭仿刺參用于正式試驗(yàn)。將仿刺參于冰上麻醉30 min,用手術(shù)刀割取體壁約1 cm2的組織 (50～100 mg),每頭仿刺參割取3～4塊組織,混合后作為正常對照組樣品,放入凍存管中,迅速投入液氮中冷凍備用。手術(shù)過的仿刺參分為5組,每組5頭,放回水槽中飼養(yǎng),分別飼養(yǎng)24、48、72、96、120 h后取創(chuàng)傷處的體壁組織 (方法同上),混合后作為創(chuàng)傷修復(fù)試驗(yàn)組樣品,放入凍存管中,液氮中冷凍備用。

1.2.2 RNA的提取及消減文庫的構(gòu)建 采用優(yōu)化過的TRIzol一步法進(jìn)行總RNA的抽提。沉淀溶于適量的DEPC水中,用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度。

將創(chuàng)傷修復(fù)組和正常仿刺參組體壁樣品的總RNA通過Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit (Clontech公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。消減文庫構(gòu)建的具體步驟參照PCR-Select cDNA Subtraction試劑盒 (Clontech公司)說明書進(jìn)行。構(gòu)建消減文庫時,正向文庫以創(chuàng)傷修復(fù)體壁為試驗(yàn)方 (tester),以正常體壁為消減方 (driver);負(fù)向文庫以正常體壁為試驗(yàn)方,以創(chuàng)傷修復(fù)體壁為消減方。其中mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,然后用RsaI充分酶切1.5 h后完成。經(jīng)接頭連接后進(jìn)行抑制性消減雜交。兩次差減PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick PCR Purification試劑盒純化后連接pMD-18-T載體,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)宿主菌 (DH-5α)中,將菌液均勻涂布于含 Apr-IPTG/x-gal的LB固體培養(yǎng)基上,于37℃下過夜。每個文庫隨機(jī)挑取384個白斑克隆,接種于LB液體培養(yǎng)基中,于37℃下過夜。取1 μL菌液,分別利用T載體通用引物 (RV-M、M13-47)和巢式引物 (nested PCR primer 1、nested PCR primer 2R),對所建立的正反向消減文庫進(jìn)行陽性克隆的檢測,反應(yīng)參數(shù)與第2次消減PCR相同。擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,有插入者加甘油保種于超低溫冰箱 (-80℃)中。

1.2.3 cDNA測序及EST序列分析 隨機(jī)挑取陽性克隆,使用MegaBACE 1000型自動測序儀測序得到cDNA序列。測序結(jié)果在GenBank(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進(jìn)行同源性比對,用BlastX程序?qū)ο麥p文庫的EST序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高質(zhì)量仿刺參體壁總RNA的提取

由于仿刺參體壁組織比較特殊,不易于直接勻漿破碎,因此,要經(jīng)液氮速凍研磨并勻漿后,再進(jìn)行RNA的提取。獲得的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測,OD260nm/OD280nm值均在1.9～2.1,說明RNA質(zhì)量較高,沒有DNA、蛋白或酚的污染。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,28S rRNA和18S rRNA兩條譜帶清晰,二者亮度比達(dá)到(2.0～2.5)∶1以上,條帶整齊,說明RNA完整性較好、純度較高,能夠滿足反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)試驗(yàn)的需要 (圖1)。

圖1 仿刺參體壁總RNA的提取結(jié)果Fig.1 Total RNA extracted from body walls of the sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 消減雜交及差異片段陽性克隆的PCR檢測

經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,cDNA為大于250 bp的片狀條帶,酶切后cDNA為100～2 000 bp的條帶,說明cDNA酶切較完全 (圖2)。對隨機(jī)挑選的陽性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果顯示片段為300～1 000 bp(圖3),且文庫中片段插入率達(dá)97%以上。

圖2 對照組和創(chuàng)傷修復(fù)組體壁cDNA及酶切后電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoretic analysis of cDNA in body walls of the sea cucumber A.japonicus in control and recovery groups

圖3 消減文庫部分克隆菌落的PCR電泳圖Fig.3 Electrophoresis photograph of colony PCR of some clones in subtracted library

2.3 斑點(diǎn)雜交

通過斑點(diǎn)雜交,分別對正向庫和反向庫的克隆進(jìn)行鑒定。即分別將正、反向消減cDNA群體作為探針,與通過菌落PCR擴(kuò)增得到的插入片段雜交,最終去除假陽性克隆 (圖4)。與正向消減cDNA探針和反向消減cDNA探針雜交的克隆共計(jì)292個陽性克隆 (e≤0.001,相似性＞40%),與兩個探針雜交信號強(qiáng)弱相近的克隆可視為背景,而與兩者均無雜交信號的克隆可能代表了極低豐度的cDNA。

圖4 斑點(diǎn)雜交對正、反向庫陽性克隆的檢測Fig.4 Dot blotting analysis of the forward and reverse clones

2.4 消減文庫EST的比對分析

篩選出的292個陽性克隆中,有105個陽性克隆在對照組中上調(diào)表達(dá),187個陽性克隆在創(chuàng)傷修復(fù)組中上調(diào)表達(dá)。從中挑選信號強(qiáng)度較強(qiáng)的224個片段進(jìn)行測序,將得到的EST片段進(jìn)行Blast同源搜索。共得到208個有效EST序列,其中171個 EST序列與數(shù)據(jù)庫中基因同源 (e≤0.001,相似性＞40%),其中153個為未知基因,18個為已知功能或已命名基因 (20個克隆)。

153個未知功能的 EST中,有 107個 (占69.93%)與?？鸑ematostella vectensis同源,37個(占24.18%)與果蠅Drosophila willistoni同源,3個 (占1.96%)與文昌魚Branchiostoma floridae同源,2個 (占1.3%)與猩猩Pongo abelii同源,與家鼠Mus musculus、海膽Strongylocentrotus purpuratus、線蟲Caenorhabditis briggsae和人體虱Pediculus humanus corporis同源的EST各1個 (圖5)。18個與已知功能同源的基因見表1。

圖5 與仿刺參未知功能EST序列相似的物種分布圖Fig.5 The organism identity predicted by unknown function EST sequences in sea cucumber A.japonicus

3 討論

棘皮動物門中的大多數(shù)動物具有再生的能力,如海星、海膽等。研究刺參的再生機(jī)制和模式,將有助于建立棘皮動物門乃至水生無脊椎動物的再生模型。再生相關(guān)基因及因子的獲得可以豐富動物的再生理論研究。

尋找與刺參再生相關(guān)的系列基因,國外普遍采用建立cDNA文庫的方法,經(jīng)比對發(fā)現(xiàn),9個Hox-型再生基因[11]、血清淀粉樣A(SAA)蛋白的同源蛋白[12]以及室管膜相關(guān)基因 (EpenHg)[13]在海參Holothuria glaberrima腸再生過程中起作用,推測這些基因可能參與海參腸形態(tài)發(fā)生、傷口愈合以及腸內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的再生。國內(nèi)Zheng等[14]在仿刺參腸再生領(lǐng)域也開展了類似的研究工作。而刺參體壁再生的分子機(jī)理研究剛剛開展,僅發(fā)現(xiàn)CD151基因在刺參體壁再生過程中大量表達(dá)[5]。大規(guī)模篩選刺參體壁再生相關(guān)基因的研究工作尚未開展,徐賽濤等[15]、周遵春等[16]分別構(gòu)建了仿刺參體壁的cDNA文庫,為刺參體壁再生的研究提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

表1 消減文庫EST比對分析結(jié)果(e≤0.001,相似性＞40%)Tab.1 Classification of the EST(e≤0.001,Identity＞40%)in SSH

SSH技術(shù)在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用逐年增多,如采用此技術(shù)在銀鯽Carassius auratus中克隆出肌酸激酶等一系列基因[17-19],在鯉 Cyprinus carpio[20-21]、虹鱒Oncorhynchus myiss[22-23]中克隆出與免疫調(diào)控相關(guān)的基因。在水產(chǎn)無脊椎動物對蝦Fenneropenaeus chinensis和皺紋盤鮑Haliotis discus hannai中該技術(shù)也得到了應(yīng)用[24-25]。本研究中將這一技術(shù)應(yīng)用于仿刺參體壁與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的EST篩選。測序后比對發(fā)現(xiàn),刺參肌動蛋白 (actin)、細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ部分序列在數(shù)據(jù)庫中已有注冊,二者在創(chuàng)傷修復(fù)過程中的表達(dá)量分別呈現(xiàn)上升和下降的趨勢,說明創(chuàng)傷修復(fù)過程中由肌動蛋白參與的細(xì)胞分裂、遷移等生理活動增強(qiáng)[26],而細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ表達(dá)量下降可能預(yù)示著創(chuàng)傷修復(fù)過程中細(xì)胞正常生命活動及代謝等受到一定影響[27]。GTP酶、細(xì)胞分裂周期2類似蛋白、核糖體蛋白L17和清道夫受體蛋白12四個EST序列與相近物種紫球海膽Strongylocentrotus purpuratus的同源性較高,進(jìn)一步研究這些基因的克隆及表達(dá)分析,對揭示棘皮動物再生的分子機(jī)理具有重要意義。與高等哺乳動物同源的基因包括有絲分裂原活化蛋白激酶、泛素特異性肽酶24和大腸癌血清抗原3,三者均在仿刺參創(chuàng)傷修復(fù)體壁中上調(diào)表達(dá)。homeobox蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,在海參 Holothuria glaberrima腸道再生中也曾被發(fā)現(xiàn)[11],說明其在生物發(fā)育、生長等過程中起著重要作用。有研究表明,翻譯延伸因子EF1α、核糖體蛋白、假尿嘧啶核苷酸合成酶A、細(xì)胞分裂周期蛋白2以及大腸癌血清抗原3與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)[28-31]。

除homeobox蛋白外,本研究中發(fā)現(xiàn)的其他17個同源基因均是在仿刺參中首次發(fā)現(xiàn),其中,細(xì)胞分裂周期基因2是細(xì)胞分裂周期基因的一種,該基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,該酶的活化是細(xì)胞分裂的增殖信號,具有啟動DNA復(fù)制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用,在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用[32]。有絲分裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞行為的調(diào)控,核糖體蛋白 (L17、L30)和60S酸性核糖體蛋白P0在蛋白質(zhì)翻譯延伸過程中起著重要作用。已有研究證實(shí),真核生物的酸性核糖體磷酸化蛋白還與細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生、侵襲以及免疫性疾病有關(guān),它與延伸因子共同作用可參與蛋白合成延伸階段的調(diào)節(jié)[33]。26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基、泛素特異性肽酶24與蛋白質(zhì)的特異性降解有關(guān)[34]。GTP酶屬于Rab家族成員,該酶主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞以及分泌過程中不同細(xì)胞器之間蛋白質(zhì)的運(yùn)輸,即調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的分泌[35]。大腸癌血清抗原、假尿苷常常被用作哺乳動物腫瘤的標(biāo)志物。細(xì)胞色素c氧化酶是線粒體呼吸鏈的組成部分之一,在細(xì)胞的能量代謝與氧化磷酸化過程中發(fā)揮重要作用,在動物體中主要參與維持正常生理功能,并與炎癥、細(xì)胞有絲分裂和特異性信號傳導(dǎo)有關(guān)[36]。肌動蛋白和微管蛋白主要構(gòu)成細(xì)胞骨架成分,對細(xì)胞分裂、細(xì)胞中物質(zhì)的運(yùn)輸起重要作用。清道夫受體蛋白是位于巨噬細(xì)胞表面的一種糖蛋白,其表達(dá)量增多可能預(yù)示著機(jī)體巨噬細(xì)胞增多或功能增強(qiáng),從而與刺參損傷、免疫相關(guān)[37]。

綜合來看,本研究中所發(fā)現(xiàn)的功能基因涉及細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞遷移、分裂增殖、基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、分化和凋亡等各種細(xì)胞生命活動的調(diào)節(jié)。這些基因有助于揭示與仿刺參再生相關(guān)的基因,也將揭示仿刺參體壁再生過程中代謝、免疫等相關(guān)基因的參與情況,為全面研究仿刺參的再生過程和相關(guān)分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。除此之外,由于刺參分類地位的特殊性,還存在大量EST與未知功能蛋白同源,隨著水產(chǎn)無脊椎動物生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的逐步豐富,這些數(shù)據(jù)將為深入挖掘刺參體壁再生的分子機(jī)理提供良好的平臺,也將為再生理論及人類醫(yī)學(xué)提供重要的參考。

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Construction and analysis of subtractive cDNA library of recovery body wall in sea cucumber Apostichopus japonicus

QIN Yan-jie,LI Xia,ZHANG Hui-min,WANG Xue

(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

A subtracted cDNA library of sea cucumber Apostichopus japonicus(body weight 65-90 g)was constructed by suppression subtractive hybridization technology(SSH)to screen EST associated with recovery body wall. The cDNA library of the test group has been constructed by the mRNA of the body walls 24,48,72,96 and 120 h after the operation,and those with no operation as the control group.Differential EST from the subtracted cDNA library have been identified by both PCR technology and dot blot hybridization.Two hundred and ninety-two positive clones were observed from total 768 clones,and 224 positive ones were sequenced.Two hundred and eight EST were found and analyzed by BlastX tool in GenBank database,in which 171 EST were homologous with sequences in the database,and 18 were high homologous with known function genes including:beta-tubulin,tubulin alpha-1 chain,actin,tRNA pseudouridine synthase A,GTPase,cell division cycle 2-like,Mitogen-activated protein kinase,homeobox protein,elongation factor 1A,ribosomal protein L30 and L17,60S acidic ribosomal protein P0,26S protease regulatory subunit,ubiquitin specific peptidase 24,serologically defined colon cancer antigen 3 and scavenger receptor cysteine-rich protein type 12 which upregulated in wounded and recovery body walls of the sea cucumber.In this study,the subtracted cDNA library was successfully constructed by SSH and a number of EST related to recovery body wall were identified,which laid a foundation for the molecular basis and the process of regeneration of body wall in the sea cucumber.

Apostichopus japonicus;body wall;suppression subtractive hybridization;cDNA library;wound and recovery

Q785;S917

A

2012-09-01

遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 (2007T015);遼寧省教育廳實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng) (2008S064)

秦艷杰 (1977-),女,副教授。E-mail:qinyanjie@dlou.edu.cn

李霞 (1961-),女,教授。E-mail:lx@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)03-0224-06