王斌,趙鳳梅,李軍偉,沈皓,王惠,胡亮

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

遲鈍愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的克隆及多重PCR檢測方法的建立

王斌,趙鳳梅,李軍偉,沈皓,王惠,胡亮

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

采用PCR法擴增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性敗血癥病原菌遲鈍愛德華氏菌Edwardsiella tarda L-49231菌株Ⅲ型分泌系統(tǒng) (TTSS)的裝置蛋白 (esaC)、效應(yīng)蛋白 (eseB、eseC、eseD)和調(diào)節(jié)蛋白(esrA、esrB)6種基因,并將其克隆到載體PMD19-T中分別進行測序;通過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立一次檢出效應(yīng)蛋白eseB、eseC和eseD 3種基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法檢測遲鈍愛德華氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙門氏菌Salmonella enterica、大腸桿菌Escherichia coli和腸桿菌Enterobacter中效應(yīng)蛋白基因的存在情況。結(jié)果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6種基因片段,大小分別為837、184、934、445、464、458 bp,與GenBank中遲鈍愛德華氏菌PPD130/91菌株的這6種基因的同源性分別為99%、97%、99%、99%、99%、98%;通過優(yōu)化反應(yīng)條件,在退火溫度為54℃,基因eseB、eseC和eseD引物濃度 (μmol/L)組合比為5∶10∶2,Mg2+濃度為1.5 mmol/L時,能夠得到清晰、穩(wěn)定且均一的多重PCR產(chǎn)物,并與目的條帶分子量一致;采用所建立的多重PCR方法進行檢測,遲鈍愛德華氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3種基因片段,遲鈍愛德華氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未檢出eseD基因片段;沙門氏菌、大腸桿菌和腸桿菌中均未檢出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法對遲鈍愛德華氏菌具有較好的特異性,可檢出具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的菌株。

遲鈍愛德華氏菌;Ⅲ型分泌系統(tǒng);克隆;多重PCR

遲鈍愛德華氏菌Edwardsiella tarda隸屬于腸桿菌科Enterobacteriaceae、愛德華氏菌屬Edwardsiella Ewing and Mcwhorter 1965[1],宿主范圍和地理分布都十分廣泛,能夠在淡水和海水中生存。主要感染低等和高等脊椎動物,如魚類[2]、兩棲類[3]、爬行類[4]、鳥類[5]和哺乳類等動物,是愛德華氏菌屬中唯一能感染人致腹瀉的細菌[6]。該菌能引起多種養(yǎng)殖魚類敗血癥,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟損失。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是遲鈍愛德華氏菌重要的致病基因簇之一,該基因簇共分4組,分別為效應(yīng)分子(ese)、裝置分子esa、調(diào)節(jié)分子esr和伴侶分子esc,其中效應(yīng)蛋白eseB、eseC、eseD是胞外產(chǎn)物的主要成分,已有研究認(rèn)為,它們可能表達細菌細胞外的某些結(jié)構(gòu),在細菌致病過程中起著重要作用[7]。本試驗中,作者選擇從患病大菱鲆 Scophthalmus maximus體內(nèi)分離到的1株強致病性遲鈍愛德華氏菌(編號L-49231)[8]為試驗對象,擴增并克隆其中6種基因片段,建立一次檢出3種效應(yīng)蛋白(ese)基因片段的多重PCR檢測方法,以期能夠有效檢出水產(chǎn)動物攜帶的致病菌株,為研究該菌的分子致病機理以及今后亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1)試驗菌株。遲鈍愛德華氏菌L-49231、沙門氏菌、大腸桿菌及腸桿菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在37℃ 下培養(yǎng) 24 h備用;遲鈍愛德華氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314用腦心浸出液培養(yǎng)基 (BHI)在28℃下培養(yǎng)24 h備用?；蚩寺『蜋z測用試驗菌株的來源見表1。

2)試驗試劑。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、BHI、PCR試劑及克隆載體等分別購自寶生物工程 (大連)有限公司和上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司; 0.5×TBE緩沖液、LB培養(yǎng)基、SOC液體培養(yǎng)基均為自行配制。

表1 試驗菌株Tab.1 The bacterium strains in this study

3)引物序列。遲鈍愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)裝置蛋白 (esaC基因)、效應(yīng)蛋白 (eseB、 eseC、eseD基因)和調(diào)節(jié)蛋白 (esrA、esrB基因)的引物分別為esaC-IF/IR,eseB-IF/IR、eseC-IF/ IR、eseD-IF/IR,esrA-IF/IR、esrB-IF/IR[7],由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,引物M13-47和RV-M購自寶生物工程 (大連)有限公司,引物序列見表2。

表2 本試驗所用引物序列Tab.2 Oligonucleotide primers used for PCR in the study

1.2 方法

1.2.1 L-49231菌株目的基因的PCR擴增 每個菌株培養(yǎng)24 h得到純的單菌落后,分別挑取3～4個菌落懸浮于50 μL滅菌超純水中,99℃下變性10 min,于4℃下保存,用于提取模板DNA。

1)目的基因擴增反應(yīng)條件。6個目的基因反應(yīng)體系相同:在50 μL反應(yīng)體系中加入10×PCR buffer(Mg2+plus)5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L) 4 μL,模板DNA 5 μL,引物esaC-IF和esa-IR (10 μmol/L)各2 μL,rTaq(5 U/μL)0.3 μL,加滅菌超純水31.7 μL補至50 μL。6個目的基因的PCR擴增程序中,除eseB和eseD基因的循環(huán)參數(shù)——退火溫度和時間分別為59℃、40 s和54℃、40 s外,其余反應(yīng)程序均為94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,52℃下退火30 s,72℃下復(fù)性1 min,共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。

2)PCR產(chǎn)物的檢測及回收。配制瓊脂糖(Agarose D-1 LE)含量為20 g/L的瓊脂糖凝膠,取PCR產(chǎn)物5 μL與1 μL 6×loading buffer混勻后點樣,進行瓊脂糖凝膠電泳,在100 V下電泳40 min左右,使用凝膠成像儀和照相系統(tǒng)記錄試驗結(jié)果。用DNA回收試劑盒回收DNA,并于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因的克隆及測序

1)裝置蛋白esaC及調(diào)節(jié)蛋白esrA、esrB基因的克隆。按照pMD19-T載體試劑盒說明書進行操作,白斑菌落用LB培養(yǎng)基劃斜面保存,并用PCR法確認(rèn)陽性克隆。PCR反應(yīng)體系為30 μL,其中: 10×PCR buffer(Mg2+plus)3 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)2.5 μL,模板DNA 3 μL,引物M13-47和RV-M(10 μmol/L)各1 μL,rTaq(5 U/μL) 0.2 μL,加滅菌超純水19.3 μL補至30 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,55℃下退火30 s,72℃下復(fù)性1 min,共進行25個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。挑選陽性克隆進行增菌、測序。

2)效應(yīng)蛋白 eseB、eseC、eseD基因的克隆。在3支PCR管中分別加入pMD19-T 1 μL,相應(yīng)的PCR產(chǎn)物2 μL,滅菌超純水2 μL,其余同上。

1.2.3 效應(yīng)蛋白 eseB、eseC、eseD基因的多重PCR條件的建立及優(yōu)化

1)退火溫度的優(yōu)化。與PCR擴增的反應(yīng)體系相同,同樣的預(yù)變性和變性條件,分別于50、52、54、56、58、60℃下退火 40 s,72℃下復(fù)性 1 min,共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min,于4℃下保存。將PCR產(chǎn)物用20 g/L凝膠電泳檢測,獲得最佳退火溫度。

2)引物濃度組合比的優(yōu)化。5種不同引物濃度組合的反應(yīng)體系:各種濃度組合加入 2 μL, rTaq DNA聚合酶0.3 μL,加滅菌超純水20.7 μL補至50 μL。將樣品混勻后,于94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,根據(jù)退火溫度試驗,選擇最佳退火溫度54℃下退火40 s,72℃下復(fù)性1 min,共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min,于4℃下保存。將PCR產(chǎn)物用20 g/L凝膠電泳檢測,分析最佳引物濃度組合比 (表3)。

表3 引物濃度組合比Tab.3 Combination of primer concentrations μmol/L

3)Mg2+濃度的優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系50 μL,其中:10×PCR buffer(Mg2+free)5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL,L-49231模板5 μL,加入經(jīng)過優(yōu)化的最佳引物濃度組合2(5∶10∶2)2 μL,分別加入25 mmol/L MgCl24.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5 μL,使終濃度分別為2.0、1.75、1.5、1.25、1.0、0.75 mmol/L,rTaq DNA聚合酶0.3 μL,分別加滅菌超純水補至50 μL。將樣品混勻后,于94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,最佳退火溫度54℃下退火40 s,72℃下復(fù)性1 min,共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min,于4℃下保存。將PCR產(chǎn)物用20 g/L凝膠電泳檢測,分析最佳Mg2+濃度。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)的特異性檢測 選用不同來源的3株遲鈍愛德華氏菌、1株沙門氏菌、1株大腸桿菌和1株腸桿菌,用上述建立的方法進行PCR擴增,以檢驗所建立多重PCR方法的特異性及效應(yīng)蛋白基因在不同細菌或菌株中的存在情況。每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴增

esaC基因擴增出一個條帶,大小為850 bp左右,無雜帶、拖帶現(xiàn)象,與文獻 [7]報道的該毒力基因相符 (圖1);eseC擴增條帶大小為900 bp左右,eseD為450 bp左右,eseB大小為200 bp左右 (圖2);esrB和esrA擴增條帶大小均為450 bp左右 (圖3)。

圖1 TTSS裝置蛋白esaC基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification of the TTSS apparatus esaC

圖2 TTSS效應(yīng)蛋白eseB、eseC和eseD基因的PCR擴增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification of the TTSS effectors eseB,eseC and eseD

圖3 TTSS調(diào)節(jié)蛋白esrA、esrB基因的PCR擴增結(jié)果Fig.3 The PCR amplification of the TTSS regulators esrA and esrB

2.2 目的基因克隆后的PCR檢測

6種目的基因均成功克隆到載體中,經(jīng)PCR檢測各條帶分子量去除載體部分均與目標(biāo)基因大小相同。esaC為837 bp,eseB、eseC、eseD基因分別為184、934、445 bp,esrA和 esrB基因為464、458 bp。

2.3 遲鈍愛德華氏菌TTSS基因的測序

將 esaC測序結(jié)果通過國際互聯(lián)網(wǎng) NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)上的VecScreen去掉其兩端的載體序列,與遲鈍愛德華氏菌 PPD130/91 TTSS裝置蛋白esaC基因 (登錄號:AAX6941.1)的同源性為 99%;同法將 eseB、eseC和 eseD與PPD130/91的3個基因 (登錄號:AAV76903.1、AAV769404.1、AAV769405.1)比對,同源性分別為 97%、99%、99%;esrA 和 esrB 基 因 與PPD130/91菌株相同基因 (登錄號:AAV69423.1和AAX76904.1)的同源性分別為99%和98%。

2.4 多重PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化

遲鈍愛德華氏菌L-49231在最佳退火溫度、最佳Mg2+濃度、不同引物濃度組合下PCR的擴增結(jié)果如圖4所示。通過多重PCR擴增得到3條均一、穩(wěn)定的條帶,3條帶大小分別為200、900、450 bp左右,與目的eseB、eseC和eseD基因的大小相符。從圖4可看出,在最佳退火溫度、最佳Mg2+濃度下,引物濃度組合比為5∶10∶2時,擴增條帶最清晰。

圖4 不同引物濃度組合下L-49231菌的多重PCR擴增結(jié)果Fig.4 The multi-PCR amplification of different primer concentration combination of L-49231

通過對多重PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化,得到最佳退火溫度為54℃。在此基礎(chǔ)上,對多重PCR反應(yīng)的引物濃度組合比和Mg2+濃度進行優(yōu)化,得出eseB、eseC、eseD最佳引物濃度 (μmol/L)組合比為5∶10∶2,最佳Mg2+濃度為1.5 mmol/L。在最佳退火溫度、最佳引物濃度組合比、最佳Mg2+濃度下,多重 PCR擴增效果最佳,eseB、eseC、eseD 3條目的條帶均較清晰。

2.5 多重PCR反應(yīng)的特異性檢測

2.5.1 遲鈍愛德華氏菌及沙門氏菌的檢測 遲鈍愛德華氏菌及沙門氏菌的多重PCR檢測結(jié)果如圖5所示。從圖5可見:遲鈍愛德華氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314均擴增出3個DNA條帶,大小分別為200、900、2 000 bp左右,其中200 bp及900 bp左右的DNA條帶與目的eseB和eseC條帶大小相符,可見在遲鈍愛德華氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314中也可以檢測到與L-49231相同的eseB和eseC基因,而2 000 bp左右的條帶與目的eseD大小 (440 bp)不一致,表明在這3株菌種不存在與L-49231相同的eseD基因;在沙門氏菌中,均未檢測到 eseB、eseC和eseD基因。

圖5 遲鈍愛德華氏菌及沙門氏菌的多重PCR檢測結(jié)果Fig.5 The multi-PCR detection of Edwardsiella tarda and Salmonella enterica

2.5.2 腸桿菌及大腸桿菌的檢測 腸桿菌及大腸桿菌的多重PCR檢測結(jié)果見圖6,在腸桿菌及大腸桿菌中均未檢測到eseB、eseC和eseD基因。

3 討論

圖6 腸桿菌及大腸桿菌的多重PCR檢測結(jié)果Fig.6 The multi-PCR detection of Escherichia coli and Enterobacter

本試驗中采用PCR擴增大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆出血性敗血癥病原菌遲鈍愛德華氏菌L-49231的TTSS基因 esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和 esrB,將PCR產(chǎn)物回收后克隆到載體PMD19-T中,并對陽性克隆產(chǎn)物進行了測序。結(jié)果得到了相應(yīng)的目的片段,大小分別為 837、184、934、445、464、458 bp,與遲鈍愛德華氏菌 PPD130/91的 esaC、eseB、eseC、eseD、esrA、esrB基因的同源性分別為99%、97%、99%、99%、99%、98%,從而在分子水平上證明了遲鈍愛德華氏菌L-49231中含有TTSS裝置蛋白 (esaC基因)、效應(yīng)蛋白 (eseB、eseC、eseD基因)和調(diào)節(jié)蛋白 (esrA、esrB基因)。在遲鈍愛德華氏菌中,已經(jīng)證實調(diào)節(jié)基因esrA-esrB是以二元復(fù)合體的形式存在,它不僅對TTSS基因的表達起調(diào)節(jié)作用,還調(diào)節(jié)TTSS基因簇之外的某些基因的表達,如evp基因[9-10],它還可以直接或間接地對黏附基因、侵襲基因起調(diào)節(jié)作用; eseB、eseC和eseD是該菌胞外產(chǎn)物中的主要成分,與野生菌相比,eseB、eseC、eseD基因的突變株將導(dǎo)致細菌毒力下降為原來的1/10,因此,eseB、eseC、eseD與細菌的毒力具有密切的關(guān)系[7]。但是,TTSS的作用機制以及各組分在細菌致病過程中的具體功能尚未明確,這些都有待進一步研究。另外,eseB基因與遲鈍愛德華氏菌的自動凝集能力有關(guān)。序列分析結(jié)果表明,eseB、eseC和eseD與沙門氏菌 S.enterica serovar Typhimurium 中的 sseB、sseC和 sseD的同源性分別為29.5%、24.4%和23.9%,因而有學(xué)者認(rèn)為,eseB、eseC和eseD蛋白在遲鈍愛德華氏菌中也同樣起著轉(zhuǎn)運的作用[7]。研究還證實了eseB、eseC、eseD蛋白在被分泌之后形成蛋白復(fù)合體,這與它們被假定的轉(zhuǎn)運作用相符[11]。因此,以eseB、eseC和eseD基因作為研究對象來探索遲鈍愛德華氏菌的多重PCR檢測方法具有十分重要的意義。本試驗中以L-49231為模板,采用遲鈍愛德華氏菌的TTSS效應(yīng)蛋白基因eseB、eseC和eseD為檢驗?zāi)繕?biāo),探索一次檢出3種基因片段的多重PCR方法。經(jīng)過反應(yīng)條件的探索及優(yōu)化,結(jié)果在退火溫度為 54℃,基因 eseB、eseC和eseD引物濃度 (μmol/L)組合比為5∶10∶2,Mg2+濃度為1.5 mmol/L時,能夠得到清晰、穩(wěn)定且均一的多重 PCR產(chǎn)物,大小分別為200、900、450 bp左右,與目的條帶大小一致。

本研究中對遲鈍愛德華氏菌不同菌株及沙門氏菌、大腸桿菌和腸桿菌 (與遲鈍愛德華氏菌同屬于腸桿菌科)進行了多重PCR檢測,結(jié)果表明:遲鈍愛德華氏菌L-49231中存在與文獻 [7]報道的 PPD130/91基本相同的 TTSS效應(yīng)蛋白基因eseB、eseC和eseD;遲鈍愛德華氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314中也具有 eseB和 eseC基因,但是在這3株菌中并未檢測到與L-49231菌株和PPD130/91菌株大小一致的eseD基因,除eseB、eseC基因外,擴增到一條分子量近2 000 bp的條帶,是否為eseD基因的變異或其他相似的基因尚不能確定。這一結(jié)果提示,分離于不同宿主的同種致病菌所攜帶的效應(yīng)蛋白基因可能不同,原因可能與致病基因的來源、細菌受環(huán)境影響發(fā)生突變等因素有關(guān),具體還有待進一步深入研究。有一點可以肯定,遲鈍愛德華氏菌的TTSS效應(yīng)蛋白基因存在一定程度的保守性,但不能排除基因水平的變異以及轉(zhuǎn)錄后水平的變化。在沙門氏菌、大腸桿菌和腸桿菌中,eseB、eseC和eseD基因均未檢測到。從以上結(jié)果推測,TTSS基因在遲鈍愛德華氏菌不同的菌株中有可能存在變異或缺失,江云等[12]在利用PCR法對國內(nèi)3株遲鈍愛德華氏菌的6個基因citC、fimA、gadB、mukF、katB和esrB檢測時也只出現(xiàn)了citC、fimA、gadB、mukF 4個毒力基因,而katB和esrB兩個毒力基因未出現(xiàn),也有文獻報道這幾個毒力基因只在國外分離株中發(fā)現(xiàn)[13],表明毒力基因在不同菌株中可能存在一定的差異,因此,eseB、eseC、eseD基因在遲鈍愛德華氏菌中的存在情況以及片段的差異還需要大量的分離株來進行檢驗。另外,由于遲鈍愛德華氏菌的TTSS基因與沙門氏菌SPI2編碼的TTSS具有一定的同源性,且遲鈍愛德華氏菌TTSS基因的分類也是根據(jù)其與沙門氏菌的TTSS基因及功能的相似性來命名的[7],故本試驗中重點對沙門氏菌進行多重PCR檢測,然而eseB、eseC和eseD基因的這3對引物并未在沙門氏菌中擴增出相應(yīng)的條帶。表明遲鈍愛德華氏菌的TTSS與沙門氏菌的TTSS在基因水平上具有較大的差異,已有文獻報道,沙門氏菌毒力島SPI2的突變導(dǎo)致該菌對小鼠毒力減弱,調(diào)節(jié)基因 (ssrA)、效應(yīng)基因 (sseA、sseB、sseC和 spiC)或裝置基因 (spiA)的失活都導(dǎo)致沙門氏菌毒力大大降低[14-16],而在遲鈍愛德華氏菌中,調(diào)節(jié)基因(esrA和esrB)的缺失導(dǎo)致遲鈍愛德華氏菌毒力的降低程度遠大于其效應(yīng)基因 (eseB、eseC和eseD)和裝置基因 (esaC)[7]。盡管在不同的遲鈍愛德華氏菌株中檢測到的這3條基因片段不盡相同,但均有相應(yīng)的產(chǎn)物出現(xiàn),并且兩條完全一樣,可以認(rèn)為該方法對遲鈍愛德華氏菌具有較好的特異性。

常亞青等[17]研究報道了采用PCR方法檢測蝦夷馬糞海膽致病菌強壯弧菌,張鳳萍等[18]和韓一凡等[19]分別報道了采用PCR方法檢測水產(chǎn)動物的病原菌,本研究中所建立的多重PCR檢測方法可有效檢出遲鈍愛德華氏菌毒株,可避免檢疫過程中非毒株檢出帶來的干擾。

綜上所述,本試驗中建立的多重PCR方法,檢測結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰,操作方便,耗時短,可應(yīng)用于遲鈍愛德華氏菌致病菌株的檢測。但由于驗證試驗選擇的菌株數(shù)較少,對檢測樣品的敏感性試驗、組織中細菌的檢出試驗等內(nèi)容尚未進行,因此,對于該方法的確立和完善還有待于大量的相關(guān)研究。

[1]Holt J G,Krieg N R,Sneath P H A,et al.Bergey's Manual of Determinative Bacteriology[M].Baltimore:Williams and Wilkins, 1994:178,204,225.

[2]Sae-Oui D,Muroga K,Nakai T.A case of Edwardsiella tarda infection in cultured colored carp Cyprinus carpio[J].Fish Pathol, 1984,9:197-199.

[3]Kourany M,Vasquez M,Saenz R.Edwardsiellosis in man and animals in Panama:clinical and epidemiological characteristics[J]. Am J Trop Med Hyg,1977,26:1183-1190.

[4]Goldstein E J C,Agyare E O,Vagvolgi A E,et al.Aerobic bacterial oral flora of garter snakes:development of normal flora and pathogenic potential for snakes and humans[J].Clin Microbiol,1981, 13:954-956.

[5]Cook R A,Tappe J P.Chronic enteritis associated with Edwardsiella tarda infection in Rockhopper penguins[J].Am Vet Med Assoc,1985,187:1219-1220.

[6]FarmerⅢJ J,Mcwhorter A C,Genus X.Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology[M].Baltimore:The Williams and WilkinsCo,1984:486-491.

[7]Tan Y P,Zheng J,Tung S L,et al.Role of typeⅢsecretion in Edwardsiella tarda virulence[J].Microbiology,2005,151:2301-2313.

[8]王斌,孫岑,范薇,等.養(yǎng)殖大菱鲆出血性敗血癥病原菌致病性研究及鑒定[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,2006,21(2):100-104.

[9]Hacker J,Blum-Oehler G,Mühldorfer I,et al.Pathogenicity islands of virulent bacteria:structure,function and impact on microbial evolution[J].Mol Microbiol,1997,23:1089-1097.

[10]Zheng J,Tung S L,Leung K Y.Regulation of a typeⅢand a putative secretion system(EVP)in Edwardsiella tarda by esrC is under the control of a two-component system esrA-esrB[J].Infection and Immunity,2005,73:4127-4137.

[11]Zheng J,Li N,Tan Y P,et al.escC is a chaperone for the Edwardsiella tarda typeⅢ secretion system putative translocon components eseB and eseD[J].Microbiology,2007,153:1953-1962.

[12]江云,李壽崧,王壽昆.致病性遲鈍愛德華氏菌毒力基因的PCR檢測[J].中國食品學(xué)報,2008,8(4):123-129.

[13]Putanae S,Srinivasa R,Tit M L,et al.Functional genomics approach to the identification of virulence genes involved in Edwardsiella tarda pathogenesis[J].Infection and Immunity,2003(3): 1343-1351.

[14]Hensel M,Shea J E,Waterman S R,et al.Genes encoding putative effector proteins of the typeⅢ secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages[J].Mol Microbiol,1998,30(1):163-174.

[15]Ochman H,Soncini F C,Solomon F,et al.Identification of a pathogenicity island required for Salmonella survival in host cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:7800-7804.

[16]Uchiya K,Barbieri M A,Funato K,et al.A Salmonella virulence protein that inhibits cellular trafficking[J].EMBO J,1999,18: 3924-3933.

[17]常亞青,封妮莎,王軼南,等.蝦夷馬糞海膽致病菌強壯弧菌的PCR檢測方法[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2012,27(4):289-293.

[18]張鳳萍,王印庚,李勝忠,等.應(yīng)用PCR方法檢測刺參腐皮綜合征病原——燦爛弧菌[J].海洋水產(chǎn)研究,2008,29(5):101-107.

[19]韓一凡,莫照蘭,李杰,等.溶藻弧菌的PCR快速檢測方法[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2009,39(6):1237-1240.

Cloning of typeⅢ secretion system genes and detection of bacterium Edwardsiella tarda by multiplex PCR

WANG Bin,ZHAO Feng-mei,LI Jun-wei,SHEN Hao,WANG Hui,HU Liang

(Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Six genes,esaC,eseB,eseC,eseD,esrA and esrB,were amplified in typeⅢsecretion system of bacterium Edwardsiella tarda L-49231 strain isolated from infected turbot Scophthalmus maximus by PCR.Then all PCR products were cloned into vector PMD19-T and the positive clones were chosen to be sequenced.The detection method of three effector protein genes of eseB,eseC and eseD were established via the optimization of reaction conditions by multiplex PCR.The multiplex PCR detection method was then applied to determine effector protein genes of different Edwardsiella tarda strains such as L-49231,GhAn080310,GhAn080313 and GhAn080314,including Salmonella enterica,Escherichia coli and Enterobacter sp.The results showed that esaC,eseB,eseC,eseD,esrA and esrB genes were all detected in L-49231 strain,with 837,184,934,445,464 and 458 bp in length,respectively.The homology with Edwardsiella tarda strain PPD130/91 from GenBank were found up to 99%,97%, 99%,99%,99%and 98%,respectively.The optimum multi-PCR was conducted under the conditions of annealing temperature 54℃,primer concentrations(μmol/L)ratio of eseB∶eseC∶eseD=5∶10∶2 and Mg2+concentration of 1.5 mmol/L.The eseB,eseC and eseD genes were all detected in Edwardsiella tarda strains L-49231, while only eseB and eseC genes were detected in Edwardsiella tarda strains GhAn080310,GhAn080313 and GhAn080314.But eseB,eseC and eseD genes were not detected in Salmonella enterica,Escherichia coli and Enterobacter sp.The findingds indicate that our approach of multi-PCR allows specific detection of strains with the typeⅢsecretion system.

Edwardsiella tarda;typeⅢsecretion system;clone;multi-PCR

S947.9

A

2012-11-08

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點實驗室項目 (2009S026)

王斌 (1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)03-0217-07