王麗，姜華軍，楊帆，杜郁，賈曉健，司書毅，洪斌

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丹酚酸B在巨噬細(xì)胞膽固醇外排中的作用

王麗，姜華軍，楊帆，杜郁，賈曉健，司書毅，洪斌

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)生部抗生素生物工程重點實驗室（王麗、姜華軍、楊帆、杜郁、賈曉健、洪斌），國家新藥（微生物）篩選實驗室（司書毅）

考察丹酚酸 B（SAB）對巨噬細(xì)胞膽固醇外排的影響。

分別采用巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 和 PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測丹酚酸 B 對已攝取DiI-acLDL 的細(xì)胞外排脂質(zhì)作用的影響，對 RAW 264.7 細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白表達(dá)水平的影響。采用 ABCA1 的抑制劑 DIDS 及小分子干擾 RNA 的方法檢測ABCA1 在丹酚酸 B 誘導(dǎo)的促進(jìn)脂質(zhì)外排過程中的作用。進(jìn)而利用靶向 CD36 的小分子干擾 RNA，通過抑制 CD36 的表達(dá)，檢測 CD36 在丹酚酸 B 促進(jìn)載脂巨噬細(xì)胞脂質(zhì)外排過程中的作用。

采用 DiI 熒光標(biāo)記的脂質(zhì)檢測巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的外排作用，結(jié)果顯示 SAB 顯著增加了荷脂細(xì)胞對 DiI-acLDL 的外排作用。對脂代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，在荷脂的 RAW 264.7 細(xì)胞中，SAB 能夠以一定劑量依賴的方式增加細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白水平的表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，上述 SAB 促進(jìn)外排的作用可被 ABCA1 的抑制劑或者 siRNA 的作用消除，確證了 ABCA1 在 SAB 介導(dǎo)的脂質(zhì)外排過程中的重要作用。同樣利用 CD36 小分子干擾 RNA 將 CD36 表達(dá)抑制后，SAB 促進(jìn)外排的作用消失，說明 SAB 介導(dǎo)的細(xì)胞脂質(zhì)的外排作用同樣依賴于 CD36。

丹酚酸 B 通過上調(diào) ABCA1 的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇或脂質(zhì)的外排，且該作用依賴于 ABCA1 及 CD36，為 SAB 抗動脈粥樣硬化作用新機(jī)制的研究提供了重要依據(jù)。

動脈粥樣硬化； 丹酚酸 B； ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 A1； 抗原， CD36； 膽固醇逆轉(zhuǎn)運

心腦血管疾病是當(dāng)今世界發(fā)病率最高的疾病之一，其致死、致殘率高居各類疾病之首。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，而脂質(zhì)代謝紊亂尤其是膽固醇代謝紊亂是其公認(rèn)的主要致病因子。大量的流行病學(xué)和臨床研究表明，血漿中低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）水平與動脈粥樣硬化危險性呈正相關(guān)[1-2]，而高密度脂蛋白（high density lipoproteins，HDL）水平與動脈粥樣硬化危險性呈負(fù)相關(guān)[3-5]。20 世紀(jì) 70 年代發(fā)現(xiàn)膽固醇攝取的 LDL 受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）調(diào)節(jié)通路[6-7]上調(diào)肝臟 LDLR 的表達(dá)成為降低血液膽固醇濃度的最主要手段。此外，要進(jìn)一步降低心血管疾病的危害，在降低 LDL-C 的同時必須從預(yù)防和（或）逆轉(zhuǎn) AS 的新的治療靶點出發(fā)來尋找具有新作用機(jī)制的藥物。近年來在新型調(diào)血脂藥物研發(fā)過程中，血漿脂蛋白代謝過程中的另兩個關(guān)鍵步驟：氧化的低密度脂蛋白（oxLDL）誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成過程，以及與 HDL 代謝密切相關(guān)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運（reverse cholesterol transfer，RCT）通路中相關(guān)的各個靶點受到人們的廣泛重視。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)修飾的 LDL（modified LDL，mLDL）（主要是 oxLDL）致 AS主要基于其參與泡沫細(xì)胞形成，進(jìn)而形成動脈粥樣硬化病灶，而 B 族清道夫受體 CD36 作為此過程的重要參與者，可無限制攝取 oxLDL（即在攝取時不受負(fù)反饋調(diào)控），在泡沫細(xì)胞形成中起重要作用[8-10]。膽固醇逆轉(zhuǎn)運是指機(jī)體將不便于進(jìn)行膽固醇調(diào)節(jié)和利用的外周組織中的膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟代謝及在固醇激素生成組織中被利用，從而可能使已經(jīng)形成的動脈粥樣硬化脂質(zhì)斑塊通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運的方式得到緩解甚至逆轉(zhuǎn)。該過程主要包括膽固醇從外周組織的流出、HDL 顆粒中膽固醇的酯化、HDL 中膽固醇酯的轉(zhuǎn)移、HDL 的清除等 4 個環(huán)節(jié)[11-12]。其中 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 ABCA1（ATP-binding cassette transporter A1）在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。ABCA1 以 ATP 為能源，可將細(xì)胞內(nèi)過剩的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運至初生的HDL，在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)清除過程中起到外排泵的作用，這是 RCT 的第一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。

前期工作中，我們針對 CD36 建立了 CD36 拮抗劑高通量篩選模型，并通過篩選獲得了一系列陽性化合物[14]，包括化合物丹酚酸 B（salvianolic acid B，SAB）。丹酚酸 B 屬于酚酸類化合物，為唇形科植物丹參（Bge）的主要藥理學(xué)活性水溶性組分之一[15]，被認(rèn)為具有抗氧化活性，可預(yù)防 LDL 氧化以及脂質(zhì)過氧化作用[16-17]。我們首次在分子水平和細(xì)胞水平證實 SAB 作為 CD36 可逆的競爭性拮抗劑，可抑制巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)以及泡沫細(xì)胞形成的作用，并證實該作用依賴于 CD36，并且 SAB 能夠抑制 oxLDL 誘導(dǎo)的 CD36 表達(dá)上調(diào)作用[18]。本工作在此基礎(chǔ)上最新發(fā)現(xiàn) SAB 作為 CD36 的小分子拮抗劑，還可促進(jìn)荷脂細(xì)胞中脂質(zhì)的外排，并證實 SAB 介導(dǎo)的細(xì)胞脂質(zhì)外排作用是通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白 ABCA1 實現(xiàn)的，且該作用同樣依賴于 CD36。由此推測 CD36 的小分子拮抗劑通過作用于 CD36，不僅可以抑制巨噬細(xì)胞對 oxLDL 的攝取及泡沫細(xì)胞的形成，而且可能通過影響巨噬細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終影響 ABCA1 表達(dá)，從而促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人單核細(xì)胞THP-1（ATCC TIB-202）、小鼠單核/巨噬細(xì)胞株RAW 264.7 (ATCC TIB-71）均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑和試劑盒 SV 總 RNA 提取試劑盒購自美國 Promega 公司；轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine? 2000）、Opti-MEM?I Reduced-Serum Medium 培養(yǎng)基、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScript III First-Strand）均購自美國 Invitrogen 公司；實時熒光定量 RT-PCR 試劑盒購自瑞士 Roche 公司；DMEM-高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基均購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；丹酚酸 B 購自中國藥品生物制品檢定所，純度為 97.2%，批號：111562-200807；DIDS 購自美國 Sigma 公司；DiI-acLDL 購自美國 Biomedical Technologies（BTI）公司；兔抗小鼠ABCA1 多克隆抗體（NB400-105）購自美國 Novus Biological 公司；小分子干擾 siRNA 由美國 Invitrogen 公司合成。

1.1.3 儀器 iQ5 實時熒光定量 PCR 儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；C6 流式細(xì)胞儀為美國 BD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人單核細(xì)胞 THP-1 為懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。THP-1 細(xì)胞經(jīng) 160 nmol/L PMA 處理 24 h 后細(xì)胞聚集貼壁，誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。RAW 264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同 THP-1。

1.2.2 小分子干擾 RNA 轉(zhuǎn)染 將 THP-1 細(xì)胞以 3 × 105個/ml 的細(xì)胞密度接種同時經(jīng)PMA 誘導(dǎo) 12 h 后細(xì)胞貼壁生長。利用 Forward Transfection轉(zhuǎn)染方法，采用 Opti-MEM?I Reduced-Serum Medium 細(xì)胞培養(yǎng)基和 LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑對相應(yīng)的RNAi 雙鏈復(fù)合物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 24 h 后，檢測基因抑制效率或繼續(xù)其他實驗操作。

1.2.3 實時熒光定量 PCR 化合物 SAB 等作用于 RAW 264.7 細(xì)胞一定時間后，用 SV 總 RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞的總 RNA，采用試劑盒SuperScript III First-Strand合成 cDNA，采用 2 × TaqMan?Gene Expression Master Mix 進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)，利用數(shù)據(jù)分析軟件分析并計算 Ct 值。以 GAPDH 為內(nèi)參，采用相對 Ct 的方法對熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量。

1.2.4 細(xì)胞表面蛋白表達(dá)水平檢測（流式細(xì)胞技術(shù)） 將 RAW 264.7 細(xì)胞接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入化合物 SAB 作用 24 h 后，消化收集細(xì)胞，經(jīng) 4%（w/v）多聚甲醛室溫固定 15 min，PBS漂洗，含 5% FBS 的 PBS 封閉 15 min，PBS 漂洗后標(biāo)記相應(yīng)一抗處理 50 min，PBS 漂洗細(xì)胞 3 ~ 5 次，隨后相應(yīng)二抗處理 50 min，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)水平的變化。其中 ABCA1 抗體以 1:50 稀釋，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的二抗以 1:150 稀釋。各組細(xì)胞樣品的平均檢測細(xì)胞數(shù)為 10000 個，每組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度以對數(shù)積分圖表示。

1.2.5 細(xì)胞外排DiI-acLDL 作用的檢測 RAW 264.7 細(xì)胞傳代后以 2 × 105個/ml 的細(xì)胞密度接種于 24 孔或 6 孔板培養(yǎng)，24 h 后，加入 2 μg/ml DiI-acLDL 37 ℃孵育 12 h 使細(xì)胞負(fù)載脂質(zhì)。加入化合物處理 12 h 后，將各組培養(yǎng)基分別加入黑色 96 孔熒光檢測板中，利用流式細(xì)胞技術(shù)對每組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。外排率（%）= [1 －（化合物處理組－空白對照組）/（荷脂細(xì)胞組－空白對照組）] × 100%。

2 結(jié)果

2.1 SAB 能夠促進(jìn)荷脂巨噬細(xì)胞脂質(zhì)的外排

利用熒光標(biāo)記的 DiI-acLDL 對 RAW 264.7 細(xì)胞的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運情況進(jìn)行了初步檢測。按照 1.2.5 中所述實驗方法，使 RAW 264.7 細(xì)胞充分?jǐn)z取 DiI-acLDL 后變?yōu)楹芍瑺顟B(tài)，加入100 μmol/L SAB，檢測 SAB 分別作用 4、12、24 h 后，對細(xì)胞中脂質(zhì)含量的影響。結(jié)果如圖 1 所示，隨著作用時間的遞增，SAB 可顯著降低荷脂細(xì)胞中 DiI-acLDL 的含量，在 3 個作用時間點的外排率分別為 6.7%、15.8%、29.8%。后續(xù)實驗均選擇作用 24 h 后進(jìn)行檢測。

圖 1 不同時間點 SAB 對 RAW 264.7 細(xì)胞外排 DiI-acLDL 作用的影響

Figure 1 SAB increases the efflux of DiI-acLDL from RAW 264.7 cells in time dependent manner

通過 3 次獨立實驗，檢測了 100 μmol/L SAB 作用 24 h 后對 RAW 264.7 細(xì)胞外排作用的影響，統(tǒng)計結(jié)果如圖 2 所示：對照組細(xì)胞幾乎沒有 DiI-acLDL 外排至培養(yǎng)基中；SAB 作用 24 h 后，細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度顯著降低，外排率為 20.7%，同時對應(yīng)培養(yǎng)基中的相對熒光強(qiáng)度顯著增加，說明 SAB 促進(jìn)了 RAW 264.7 細(xì)胞對 DiI-acLDL 的外排，推測這一作用是通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)的。另外，我們還采用了 PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞，對 SAB 促進(jìn)巨噬細(xì)胞外排 DiI-acLDL 的作用進(jìn)行了檢測，結(jié)果與上述 SAB 在 RAW 264.7 細(xì)胞上的作用一致。

2.2 SAB 對巨噬細(xì)胞脂代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的影響

ABCA1 在膽固醇清除過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，因此我們檢測了 SAB 對 RAW 264.7 細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白表達(dá)的影響。按照實驗方法 1.2.4中所述，采用 RAW 264.7 細(xì)胞，加入 SAB 作用 24 h，固定細(xì)胞后標(biāo)記相應(yīng)抗體，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白水平的變化。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAB 沒有顯著地影響 RAW 264.7 細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白的表達(dá)。

圖 2 SAB 促進(jìn) RAW 264.7 細(xì)胞對 DiI-acLDL 的外排作用[A：各組細(xì)胞熒光值檢測結(jié)果；B：各組細(xì)胞相對應(yīng)的培養(yǎng)基中的熒光值檢測結(jié)果；*P < 0.05，***P < 0.001 和 NS 無顯著差異（n = 3）]

Figure 2 SAB significantly increases the efflux of DiI-acLDL from RAW 264.7 cells [A: DiI fluorescence of RAW 264.7 cells was detected by flow cytometer; B: DiI fluorescence in medium was detected using multimode microplate reader;*< 0.05,***< 0.001 and NS not significant (n = 3)]

RAW 264.7 細(xì)胞在荷脂狀態(tài)下，按照上述實驗方法接種細(xì)胞后，單獨加入 oxLDL 作用或同時加入 oxLDL 和 SAB 共同孵育 24 h，其余操作步驟同上。檢測結(jié)果顯示，在 25 μg/ml oxLDL 存在的情況下，100 μmol/L 和 400 μmol/L SAB 可以一定劑量關(guān)系上調(diào) RAW 264.7 細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白水平的表達(dá)，上調(diào)率分別為 38.8% 和 92.9%（圖 3），說明 SAB 可增加荷脂的 RAW 264.7 細(xì)胞表面 ABCA1 的表達(dá)。

2.3 ABCA1 在SAB 介導(dǎo)的脂質(zhì)外排中的作用

采用 ABCA1 抑制劑DIDS[19]，通過阻斷脂質(zhì)的外排，從而對其作用進(jìn)行檢測。以 DiI-acLDL（2 μg/ml）與巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 共同孵育 12 h 后，將 DIDS（100 nmol/L）和 SAB（100 μmol/L）共同或單獨作用 24 h，利用流式細(xì)胞技術(shù)對經(jīng)不同處理的各組細(xì)胞的熒光值進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖 4 所示，DIDS 可顯著抑制 SAB 介導(dǎo)的荷脂的 RAW 264.7 細(xì)胞對 DiI-acLDL 外排的作用，說明 SAB 是通過作用于 ABCA1，從而促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)的外排。

圖 3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測 oxLDL 存在的情況下 SAB 對 ABCA1 蛋白水平的影響

Figure 3 Flow cytometry analysis for the effect of SAB on ABCA1 protein level in presence of oxLDL in RAW 264.7 cells. Negative control cells were neither treated by SAB nor incubated with primary antibody, vehicle cells were not treated by SAB before incubated with primary antibody and secondary antibody

圖 4 DIDS 對 SAB 介導(dǎo)的促進(jìn) DiI-acLDL 外排作用的影響[***P < 0.001 和NS 無顯著差異（n = 3）]

Figure 4 The effect of SAB on DiI-acLDL efflux from RAW 264.7 cells with/without DIDS [***< 0.001 and NS not significant (n = 3)]

進(jìn)而采用 RNA 干擾（RNAi）技術(shù)，對上述結(jié)果進(jìn)行了驗證。將 THP-1 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并以 160 nmol/L PMA 誘導(dǎo) 24 h 后分化為巨噬細(xì)胞，將 ABCA1 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 24 h后，加入 DiI-acLDL（2 μg/ml）與 THP-1（PMA）細(xì)胞共同孵育 12 h，使細(xì)胞充分荷脂，隨后加入 SAB（100 μmol/L）作用 24 h 后檢測。結(jié)果顯示，在 scrambled siRNA 對照組中，SAB 能夠顯著降低荷脂細(xì)胞內(nèi) DiI-acLDL 的含量（c 柱與 b 柱相比），當(dāng) ABCA1 的表達(dá)被抑制后，SAB 促進(jìn)荷脂細(xì)胞對 DiI-acLDL 外排的作用減小且無顯著性差異（f 柱與 e 柱相比），外排率由 38.8% 變?yōu)?2.6%（c 柱與f 柱相比差異顯著），說明 SAB 是通過 ABCA1 發(fā)揮促進(jìn)巨噬細(xì)胞外排 DiI-acLDL 的作用（圖 5），其中 ABCA1 siRNA 的有效抑制率為 73.8%。

圖 5 ABCA1 表達(dá)抑制對 SAB 介導(dǎo)的促進(jìn)巨噬細(xì)胞外排 DiI-acLDL 作用的影響[*P < 0.05 和 NS 無顯著差異（n = 3）]

Figure 5 The effect of SAB on the efflux of DiI-acLDL from PMA-induced THP-1 cells with/without ABCA1 siRNA [*< 0.05 and NS not significant (n = 3)]

圖 6 CD36 表達(dá)抑制對 SAB 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞外排 DiI-acLDL 作用的影響[*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 和 NS 無顯著差異（n = 3）]

Figure 6 The effect of SAB on the efflux of DiI-acLDL from PMA-induced THP-1 cells with/without CD36 siRNA [*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001 and NS not significant (n = 3)]

2.4 SAB 促進(jìn)脂質(zhì)外排的作用依賴于 CD36

通過 RNA 干擾的方法抑制 CD36 基因的表達(dá)，之后按照上述方法利用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測細(xì)胞充分?jǐn)z取 DiI-acLDL 后 SAB 對細(xì)胞中脂質(zhì)含量的影響。實驗采用經(jīng)160 nmol/L PMA 誘導(dǎo)后的 THP-1 巨噬細(xì)胞，將 CD36 siRNA 或scrambled siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 24 h 后，加入 DiI-acLDL（2 μg/ml）與 THP-1（PMA）細(xì)胞共同孵育 12 h，使細(xì)胞充分荷脂，加入 SAB（100 μmol/L）作用 24 h 后檢測。結(jié)果顯示，在 scrambled siRNA 對照組中，SAB 能夠顯著降低荷脂細(xì)胞內(nèi) DiI-acLDL 的含量（c 柱與 b 柱相比），外排率為 34.2%；而當(dāng) CD36 的表達(dá)被抑制后，SAB 促進(jìn)荷脂細(xì)胞對 DiI-acLDL 外排的作用基本消失（f 柱與 e 柱相比無顯著性差異），且 c 柱與 f 柱相比差異顯著（圖 6）。說明 SAB 促進(jìn)巨噬細(xì)胞外排 DiI-acLDL 的作用依賴于 CD36。

3 討論

丹酚酸 B 屬于酚酸類化合物，為唇形科植物丹參的主要藥理學(xué)活性水溶性組分之一[15]。注射用丹參多酚酸鹽已在臨床上被廣泛應(yīng)用于冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療，其主要成分為 SAB 鎂鹽（> 80%）[20]。目前普遍認(rèn)為 SAB 的作用機(jī)制為其抗氧化、清除自由基的活性。本課題組前期工作中發(fā)現(xiàn) SAB 通過拮抗 CD36與 oxLDL 的結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取，提示這可能是 SAB抗動脈粥樣硬化的一個新的作用機(jī)制[18]。在此基礎(chǔ)上，本工作發(fā)現(xiàn) SAB 還可通過上調(diào) ABCA1 的表達(dá)，從而促進(jìn)荷脂細(xì)胞中脂質(zhì)的外排，更進(jìn)一步豐富了 SAB 在抗動脈粥樣硬化過程中的作用，為 SAB 更好地應(yīng)用于臨床提供了新的理論依據(jù)。

ABCA1 通過將細(xì)胞中過剩的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運出胞，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運的起始步驟中起到關(guān)鍵作用。小鼠 ABCA1 功能的缺失可導(dǎo)致 HDL 膽固醇的不足[21]。而在 ABCA1 敲除小鼠中轉(zhuǎn)入人 ABCA1，其蛋白表達(dá)水平與野生型小鼠相當(dāng)，并且完全補(bǔ)償了膽固醇外流活性及脂質(zhì)水平[22]。另外，人 ABCA1 的基因突變可導(dǎo)致 Tangier 病[23]和家族性膽固醇缺失（familial HDL deficiency，F(xiàn)HA）[24]。這些結(jié)果說明 ABCA1 在 HDL 膽固醇代謝，尤其是外周細(xì)胞中膽固醇的外流中發(fā)揮了重要的作用，上調(diào) ABCA1 的表達(dá)很可能成為抗動脈粥樣硬化藥物發(fā)現(xiàn)的新途徑。對其調(diào)控機(jī)制研究顯示，ABCA1 基因啟動子區(qū)包含一個 LXR 順式作用元件，Repa 等[25]研究發(fā)現(xiàn) LXR 通過與 RXR 形成異源二聚體調(diào)控 ABCA1 的表達(dá)，激活 LXR 信號通路可增加 ABCA1 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程，加速膽固醇清除。此外，PPARγ可通過作用于 LXRα 或 CD36 的啟動子區(qū)調(diào)控其表達(dá)。

在本工作中我們采用 DiI 熒光標(biāo)記的脂質(zhì)檢測了巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的外排作用，結(jié)果顯示SAB 顯著增加了荷脂細(xì)胞對 DiI-acLDL 的外排作用，推測其通過促進(jìn)脂質(zhì)外流在膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮了重要的作用。對脂代謝相關(guān)受體或轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，在荷脂的 RAW 264.7 細(xì)胞中，SAB 能夠以一定劑量依賴的方式增加細(xì)胞表面 ABCA1 蛋白水平的表達(dá)，因此推測 SAB 可能通過上調(diào)荷脂的巨噬細(xì)胞 ABCA1 的表達(dá)在膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究顯示，上述 SAB 促進(jìn)外排的作用可被 ABCA1 的抑制劑或者 siRNA 的作用消除，確證了 ABCA1 在 SAB 介導(dǎo)的脂質(zhì)外排過程中的重要作用。

本工作首次發(fā)現(xiàn)，SAB 作為 CD36 拮抗劑同時在細(xì)胞脂質(zhì)攝取和外排中發(fā)揮作用。前期工作已證實 SAB 介導(dǎo)的抑制脂質(zhì)攝取作用依賴于 CD36[18]，本研究發(fā)現(xiàn)，CD36 表達(dá)抑制后 SAB 促進(jìn)外排的作用消失，說明 SAB 介導(dǎo)的細(xì)胞脂質(zhì)的外排作用同樣依賴于 CD36，提示 SAB 在細(xì)胞對脂質(zhì)攝取和外排兩方面的作用是相關(guān)的。CD36 作為細(xì)胞表面膜受體，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中也發(fā)揮了重要的作用。CD36 作為重要的信號傳遞受體，參與形成了復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10]。另有文獻(xiàn)[26]報道，生長激素釋放多肽（GHRPs）可作為 CD36 的配基，在心血管疾病方面具有重要作用。其中，GHRP 家族的六肽化合物 hexarelin 可以與 oxLDL 競爭性結(jié)合 CD36 并影響巨噬細(xì)胞對 oxLDL 的攝取，從而發(fā)揮了保護(hù)心血管的作用[27]。由 GHRPs 家族衍生而來的 EP 80317作為 CD36 選擇性配基，在拮抗 CD36 與 oxLDL 結(jié)合的同時可以通過上調(diào) PPARγ-LXRα-ABCA1 轉(zhuǎn)運蛋白的信號通路，促進(jìn)膽固醇外排，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化活性[28-29]。Hexarelin 和 EP 80317均屬多肽類，需靜脈注射給藥?；诒狙芯揩@得的結(jié)果，SAB 表現(xiàn)出類似于 EP 80317 的活性，而小分子化合物往往比多肽類化合物穩(wěn)定性好且不易降解。據(jù)此推測的 SAB 介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)作用通路：oxLDL 可通過 LXR 上調(diào) ABCA1 的表達(dá)，但 oxLDL 同時可激活 CD36 正反饋調(diào)控導(dǎo)致 oxLDL 的無限制攝?。籗AB 一方面可拮抗 CD36 對 oxLDL 的結(jié)合，另一方面，SAB 雖不能直接上調(diào) LXR，但可能通過其他途徑增加巨噬細(xì)胞表面 ABCA1 的表達(dá)，既抑制了攝取，又促進(jìn)了外排。進(jìn)一步信號通路的研究有待于深入開展。

綜上所述，SAB 可通過競爭結(jié)合 CD36，抑制巨噬細(xì)胞對 mLDL 的攝取，同時可能影響一系列胞內(nèi)信號通路，上調(diào)膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞膽固醇或脂質(zhì)的外排，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，為 SAB 發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用新機(jī)制的研究提供了重要依據(jù)。結(jié)合清除自由基、抗氧化等已知活性，SAB 在抗動脈粥樣硬化藥物研發(fā)方面很有廣闊的發(fā)展前景。此外，SAB 還可作為工具藥物，對膽固醇代謝相關(guān)信號通路研究具有重要意義。

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Salvianolic acid B promotes cholesterol efflux from macrophages

WANG Li, JIANG Hua-jun, YANG Fan, DU Yu, JIA Xiao-jian, SI Shu-yi, HONG Bin

: Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics of Ministry of Health (WANG Li, JIANG Hua-jun, YANG Fan, DU Yu, JIA Xiao-jian, HONG Bin), National Laboratory for Screening New Microbial Drugs (SI Shu-yi), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

To investigate the effect of salvianolic acid B (SAB) on cholesterol efflux from macrophages.

The effect of SAB on cholesterol efflux from RAW 264.7 cells and PMA-induced THP-1 cells loaded with DiI-acLDL was detected by flow cytometry analysis. The expression of ABCA1 in RAW 264.7 cells regulated by SAB was detected using flow cytometry. Then ABCA1 inhibitor DIDS and ABCA1 siRNA were applied to investigate the role of ABCA1 in SAB-mediated cholesterol efflux. The role of CD36 in this process was also detected by CD36 siRNA interference.

Macrophages loaded with DiI-acLDL were used and the DiI fluorescence in the macrophages or medium was detected respectively. The results showed that SAB significantly promoted cholesterol efflux from DiI-acLDL-loaded macrophages. The expression of transporters in lipid metabolism was also detected. SAB upregulated ABCA1 protein level in lipid-rich RAW 264.7 cells in a dose-dependent manner. Further investigation using ABCA1 inhibitor or siRNA revealed that ABCA1 played an important role in SAB mediated cholesterol efflux. Similar role of CD36 in this process was testified by attenuating CD36 mRNA level, implicating that the cholesterol efflux mediated by SAB was dependent on CD36.

SAB promotes cholesterol efflux from macrophages through upregulating ABCA1 expression, which is dependent on ABCA1 and CD36, providing an important basis for the investigation of novel anti-atherosclerosis mechanisms of SAB.

Atherosclerosis; Salvianolic acid B; ATP-binding cassette transporter A1; Antigens, CD36; Reverse cholesterol transport

HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金（81102442）；2011 年度協(xié)和青年科研基金；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項“十二五”實施計劃（2012ZX09301002-003、2012ZX09301002-001）

洪斌，Email：binhong69@hotmail.com

2012-12-07

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.004