鄒文燾，劉廣鵬，孫劍，崔磊

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應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測組織工程骨牛血清白蛋白殘余量的實(shí)驗(yàn)研究

鄒文燾，劉廣鵬，孫劍，崔磊

200072 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（鄒文燾），整形外科（劉廣鵬）；200235 上海組織工程研究與開發(fā)中心（孫劍、崔磊）

檢測常規(guī)體外構(gòu)建的組織工程骨中牛血清白蛋白殘余量，并探討減少其殘留量的方法。

體外分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，取第 2 代細(xì)胞（P2）接種于完全脫鈣骨支架材料并成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 2 周，體外構(gòu)建組織工程骨。成骨誘導(dǎo)液為含 10% 胎牛血清的條件培養(yǎng)液，并于檢測前 1 天更換為無血清的條件培養(yǎng)液。待測組織工程骨先經(jīng) 1:100（v:v）生理鹽水浸洗 3 次，然后加入磷酸鹽緩沖液（PBS），37 ℃振蕩浸提 24 h，獲取浸提液。同法獲取未接種細(xì)胞的單純支架材料的浸提液作為對照組。采用酶聯(lián)免疫法檢測樣品浸提液中牛血清白蛋白的殘余量，比較兩者牛血清白蛋白殘余量的差異。

經(jīng)生理鹽水洗滌 3 次后，洗滌液中的牛血清白蛋白含量明顯降低。酶聯(lián)免疫法測定的組織工程骨與單純支架材料的牛血清白蛋白殘余量分別為（15.57 ± 5.82）ng 和（14.85 ± 5.06）ng，單位重量的牛血清白蛋白殘余量分別為（0.254 ± 0.088）ng/mg 和（0.306 ± 0.079）ng/mg，兩組相比均無顯著性差異（> 0.05，n = 10）。

酶聯(lián)免疫法適用于組織工程骨中牛血清白蛋白殘余量的檢測。因?yàn)橹Ъ懿牧陷^細(xì)胞更易吸附牛血清白蛋白，現(xiàn)有條件下構(gòu)建的組織工程骨牛血清白蛋白殘余量仍然較高，需要繼續(xù)探索降低其殘余含量的新方法。

血清白蛋白，牛； 酶聯(lián)免疫吸附測定； 組織工程骨； 殘余量

胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）是重要的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，其主要成分有牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其他細(xì)胞生長因子等。而 BSA是其中含量最高的蛋白質(zhì)成分（> 40%），作為異種蛋白，BSA 殘余量過高會導(dǎo)致人體過敏反應(yīng)。因此藥典規(guī)定疫苗成品的 BSA 殘余量每件不超過 50 ng[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 定量檢測牛血清白蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒（40 ng/ml），購自無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DMEM 低糖培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；FBS 購自 Hyclone 公司；地塞米松、β-磷酸甘油鈉和維生素 C 為美國 Sigma 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 Beckman XL90 低溫離心機(jī)為德國 Beckman 公司產(chǎn)品；Bio-Rad iMark 酶標(biāo)儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；TC-100B 恒溫水平搖床為上海領(lǐng)成生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織工程骨的體外構(gòu)建 待測樣品為具有生物活性的組織工程骨，具體制備方法參見文獻(xiàn)[4-5]。簡言之，體外分離培養(yǎng)正常人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）至第 2 代（passage 2，P2）作為種子細(xì)胞。選擇孔隙率為 80% ~ 85% 的豬松質(zhì)骨來源完全脫鈣骨材料（demineralized bone matrix，DBM，由上海組織工程研究與開發(fā)中心研制）為支架材料。將已高溫高壓消毒的 DBM 材料（規(guī)格大小為 4 mm ×4 mm × 4 mm）置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，取 P2 代人 BMSCs 以 1 × 106/ml 的密度接種 DBM 支架材料。每塊材料接種 10 μl 細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量為 1 × 104個。將細(xì)胞材料復(fù)合物置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 4 h 后，轉(zhuǎn)移至 96 孔培養(yǎng)板，每孔加入 200 μl 成骨條件培養(yǎng)液（含低糖 DMEM、10% FBS、10-8mol/L 地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉和 10-4mol/L 維生素 C）在 37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 2 周后，于檢測前 1 天更換為無血清的條件培養(yǎng)液，制備成待檢測的組織工程骨樣品。對照組為未接種細(xì)胞的 DBM 材料，同樣置于 200 μl 成骨條件培養(yǎng)液中 2 周，檢測前 1 天更換為無血清的條件培養(yǎng)液。

1.2.2 酶聯(lián)免疫分析法測定原理 應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法測定標(biāo)本中 BSA 含量。首先用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體。包被單抗的微孔中加入 BSA 抗原，經(jīng)過結(jié)合、洗滌后加入酶標(biāo)抗 BSA 抗體，洗滌后用顯色劑顯色。顏色的深淺和樣品中的 BSA 含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長下測定吸光度（值），計(jì)算樣品濃度。

1.2.3 樣品準(zhǔn)備 取出組織工程骨樣品，以體積比 1:100 的 37 ℃溫?zé)嵘睇}水浸泡并洗滌3 次，每次 10 min，然后將樣品置于濾紙上吸附殘余液體，用眼科剪剪碎，稱重，置于 1.5 ml 的 Eppendorf 管中。根據(jù)《醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于試驗(yàn)材料浸提液的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[6]，每 0.2 g 樣品加入 1 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS）平放固定于搖床內(nèi)，37 ℃、150 r/min 振蕩浸提 24 h。對照組樣品同法處理獲取浸提液。每例樣品吸取 0.3 ml 浸提液待測。另將組織工程骨樣品 3 次浸泡沖洗后的生理鹽水也分別取樣檢測其中的 BSA 含量。

1.2.4 操作步驟 96 孔酶標(biāo)板（試劑盒自備）分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔（復(fù)孔數(shù)均為 3）。除空白孔加入 100 μl PBS 外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品 100 μl。輕輕混勻，加蓋，37 ℃溫育 30 min。將酶標(biāo)板取出棄去液體，甩干，每個孔中加滿洗滌液，反應(yīng) 30 s 后甩去液體，在濾紙上將酶標(biāo)板拍干，重復(fù)此步驟 5 次。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入 100 μl 的酶標(biāo)偶合溶液，37 ℃溫育 30 min。洗板 5 次，甩干。依序每孔加底物溶液100 μl，37 ℃避光顯色 15 min。依序每孔加終止溶液 50 μl，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀 450 nm 波長測量各孔的光密度（值）。

1.2.5 結(jié)果計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），用 Microsoft Excel 統(tǒng)計(jì)軟件算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式。將樣品值代入方程式，算出樣品實(shí)際濃度。

在設(shè)計(jì)行星機(jī)構(gòu)之初,一般要確定一個行星架固定時太陽輪到齒圈的理論速比,最終由于上述3個配齒條件限制,使得由行星機(jī)構(gòu)齒數(shù)比表示的實(shí)際速比與理論速比產(chǎn)生一定的偏差，即

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織工程骨的體外構(gòu)建

組織工程骨的支架材料為 DBM，規(guī)格大小為 4 mm × 4 mm × 4 mm（圖 1A）。顯微 CT 和掃描電鏡觀察可見 DBM 的三維多孔超微結(jié)構(gòu)（圖 1B、C）。種子細(xì)胞為正常人 P2 代 BMSCs（圖 1D），接種 DBM 后，細(xì)胞材料復(fù)合物在體外繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 2周。倒置相差顯微鏡觀察見 BMSCs 在 DBM 孔隙間生長旺盛，形成細(xì)胞膜片（圖 1E）。掃描電鏡檢測顯示細(xì)胞分泌較多細(xì)胞外基質(zhì)，覆蓋在材料表面（圖 1F）。

2.2 酶聯(lián)免疫法檢測 BSA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

BSA 檢測試劑盒檢測范圍為 0 ~ 40 ng/ml，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線2= 0.9947，符合試劑盒規(guī)定的2> 0.95 的標(biāo)準(zhǔn)檢測要求（圖 2）。

2.3 洗滌液 BSA 含量測定

組織工程骨樣品以體積比 1:100 的生理鹽水浸泡并洗滌 3 次，通過測定洗滌液中 BSA 含量，可發(fā)現(xiàn)隨洗滌次數(shù)增多，BSA 含量明顯降低。3 次洗滌的洗滌液 BSA 濃度分別為（86.35 ± 0.66）、（23.44 ± 0.27）和（1.88 ± 0.10）ng/ml，3 次之間的結(jié)果都有顯著性差異（n = 10，< 0.001，圖 3）。

2.4 組織工程骨 BSA 殘余量測定

實(shí)驗(yàn)所用 DBM 材料的體積大小均為 64 mm3，其中實(shí)驗(yàn)組平均干重為（61.63 ± 12.36）mg，對照組為（64.50 ± 14.50）mg，兩組重量比較無顯著性差異（> 0.05，n = 10）。實(shí)驗(yàn)組平均每塊組織工程骨的 BSA 殘余量為（15.57 ± 5.82）ng，單位重量的 BSA 殘余量為（0.254 ± 0.088）ng/mg。對照組的相應(yīng)值分別為（14.85 ± 5.06）ng 和（0.306 ± 0.079）ng/mg，兩組間比較均無顯著性差異（> 0.05，n = 10）。

圖 1 A：實(shí)驗(yàn)所用 DBM 材料的大體照片，規(guī)格為 4 mm × 4 mm × 4 mm；B：顯微 CT 顯示 DBM的多孔微觀結(jié)構(gòu)；C：未接種 BMSCs 之前的 DBM 掃描電鏡圖片；D：種子細(xì)胞為人 P2 代 BMSCs；E：接種 BMSCs 并成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 2 周之后的光鏡觀察，細(xì)胞在材料孔隙間生長旺盛，形成細(xì)胞膜片（箭頭所示）；F：掃描電鏡觀察，BMSCs 分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì)并覆蓋在 DBM 表面

Figure 1 A: Gross observation of DBM scaffolds used in this experiment with size of 4 mm × 4 mm × 4 mm; B: The porous microstructure of DBM shown by micro-CT; C: Scanning electron microscopy (SEM) image of DBM without BMSCs; D: Human BMSCs of passage 2; E: After 2 weeks of osteogenic induction, cell-sheet could be found between the pores of DBM; F: BMSCs excreted large amounts of extracellular matrix and covered on the surface of DBM observed by SEM

圖 2 酶聯(lián)免疫法測試BSA 殘余量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 = 0.9947

Figure 2 The standard curve of residual BSA detected by ELISA,2= 0.9947

3 討論

BSA 是牛血清中含量最高的蛋白質(zhì)成分（35 ~ 50 g/L），也是最重要的載體蛋白，可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)生長因子、激素、脂肪酸、膽固醇、維生素、金屬離子等，以利于細(xì)胞的解毒和攝取營養(yǎng)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長[7]。但 BSA 對于人體是一種異種變應(yīng)原，有導(dǎo)致人體免疫反應(yīng)的可能性。同時 BSA 可能攜帶一定種類的病毒微生物，具有傳播牛腦部海綿狀病變（bovine spongiform encephalopathy，瘋牛?。┑臐撛谖ｋU[8]。因此 BSA 殘余量的多少關(guān)系到生物制品的安全性是否合格，進(jìn)而影響到人體健康。

圖 3 組織工程骨樣品洗滌液中 BSA 含量的變化情況

Figure 3 Variation of BSA content of sample in the dilution liquid

目前國際上對組織工程醫(yī)療產(chǎn)品中 BSA 殘余量的要求尚無定論。依據(jù)世界衛(wèi)生組織及《中國藥典》規(guī)定，疫苗中 BSA 限量是 50 ng/件，因此國內(nèi)組織工程領(lǐng)域基本是參照此項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)要求開展相關(guān)研究的。但是疫苗單支劑量相對固定，差異性小，便于建立相對統(tǒng)一的 BSA 殘余量標(biāo)準(zhǔn)。而在組織工程骨的臨床應(yīng)用中，根據(jù)疾病所致骨缺損大小不同，所需植入的組織工程骨材料規(guī)格差異很大，相應(yīng)的 BSA 殘余量差異也大。本實(shí)驗(yàn)顯示，規(guī)格大小為 64 mm3的組織工程骨樣品，經(jīng)清洗后的 BSA 殘余量平均值為 15.57 ng。若修復(fù)骨缺損的材料體積為 2 cm3，其規(guī)格大小對于臨床應(yīng)用來說并不是很大，但相應(yīng)的 BSA 殘余量將達(dá)到 486.56 ng，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出藥典的規(guī)定劑量。因此，研究如何降低組織工程化醫(yī)療產(chǎn)品中的殘余 BSA 含量就顯得非常重要[9]。目前的主要途徑有：①在組織工程化產(chǎn)品制備過程中減少牛血清的應(yīng)用，尋找牛血清的替代品；②在組織工程化組織植入體內(nèi)之前，進(jìn)行規(guī)范化清洗。

牛血清替代物主要有人血小板裂解液（human platelet lysates，HPL）、自體血清（autologous serum，AS）等。許茹等[10]對機(jī)采血小板進(jìn)行反復(fù)凍融來獲得人 HPL，通過血小板裂解能夠釋放多種細(xì)胞因子，可以在 BMSCs 的體外擴(kuò)增過程中代替 FBS，獲得臨床所需數(shù)量的 BMSCs，且并沒有引起 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞周期等生物學(xué)特性的改變。而 Bottenstein 和 Sato[11]在 1979 年首次發(fā)表了用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行大鼠垂體細(xì)胞（GH3）培養(yǎng)的報道，此后各國學(xué)者先后在 30 余種細(xì)胞系的體外培養(yǎng)中獲得了成功。無血清培養(yǎng)技術(shù)將是組織工程技術(shù)的發(fā)展方向，但是目前無血清培養(yǎng)的促增殖效率尚不令人滿意，而自體血清較為稀缺，難以獲得。

在種子細(xì)胞增殖階段，所用的動物血清很容易通過離心洗滌的方法去除。當(dāng)細(xì)胞與支架材料復(fù)合后，培養(yǎng)基中的血清成分會被支架大量吸附，此時難以再將血清從支架中分離出來。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，接種 BMSCs 的組織工程骨與未接種細(xì)胞的 DBM 材料相比，兩者單位重量的 BSA 殘余量無顯著性差異，表明支架材料較細(xì)胞更容易吸附殘留 BSA。有研究設(shè)想把細(xì)胞接種支架材料作為血清替代品和動物血清應(yīng)用的分界線，在種子細(xì)胞增殖階段使用動物血清，細(xì)胞與支架材料復(fù)合后換用 AS。羅飛等[12]報道，自體血清對 BMSCs 具有良好的促增殖作用，而且自體血清對經(jīng)過動物血清培養(yǎng)的 BMSCs 進(jìn)行再序貫培養(yǎng)的促增殖效率影響輕微，因此組織工程骨種子細(xì)胞接種支架后換用自體血清具有一定的可行性。

為了清除殘余 BSA，組織工程醫(yī)療產(chǎn)品在植入前必須經(jīng)過規(guī)范化的清洗。清洗所用的試劑以及流程對 BSA 殘余量都有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，隨洗滌次數(shù)增多，樣品洗滌液中的 BSA 含量明顯降低。因此現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的組織工程醫(yī)療產(chǎn)品在真正進(jìn)入臨床使用之前，有必要依據(jù)不同的臨床預(yù)期用途，選擇合適的清洗試劑，制定相應(yīng)的操作流程。組織工程骨一般為多孔支架結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)決定了需要充分的時間及一定次數(shù)的漂洗才能有效清除殘留在其中的 BSA。但清洗時間過長或次數(shù)過于頻繁會影響活細(xì)胞的生物學(xué)活性。因此，為了在生物安全性與產(chǎn)品有效性之間取得平衡，制定清洗程序時不但要檢測 BSA 的殘余量是否符合人體安全標(biāo)準(zhǔn)，同時需確保產(chǎn)品的生物學(xué)活性（如細(xì)胞活性與功能）能夠達(dá)到要求。理想的清洗流程應(yīng)在有效清除殘余 BSA 的同時，最大限度地保持組織工程產(chǎn)品的生物活性，以便植入體內(nèi)后發(fā)揮最大的效應(yīng)，而這方面的研究目前尚未引起足夠重視[13]。

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Quantitative detection of residual BSA in tissue engineered bone by enzyme-linked immunosorbent assay

ZOU Wen-tao, LIU Guang-peng,SUN Jian, CUI Lei

Department of Otolaryngology (ZOU Wen-tao), Department of Plastic and Reconstructive Surgery (LIU Guang-peng), Shanghai Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200235, China (SUN Jian, CUI Lei)

To detect the residual bovine serum albumin (BSA) in tissue engineered bone constructed conventionallyby enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and investigate methods to reduce it.

Human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated and cultured, and BMSCs of passage 2 were inoculated in demineralized bone matrix scaffolds and induced osteogenesisfor two weeks to construct tissue engineered bone. Osteogenesis inducing medium was conditioned medium containing 10% fetal bovine serum, and was replaced with serum-free conditioned medium 1 day before detection. Then the tissue engineered bone was rinsed in 1:100 (v:v) saline for three times, put in PBS buffer and extracted for 24 hours at 37 ℃ to obtain the extracted liquor. The extracted liquor of scaffold alone without cells inoculated simultaneously served as the control. Residual BSA content in the extracted liquor were detected by ELISA and compared between the two groups.

BSA content in the dilution liquid decreased after washing three times. The average residual BSA in tissue engineered bone and in scaffold material detected by ELISA was (15.57 ± 5.82) ng and (14.85 ± 5.06) ng, respectively, which was normalized as (0.254 ± 0.088) ng/mg and (0.306 ± 0.079) ng/mg, respectively, showing no significant difference between two groups (> 0.05, n = 10).

ELISA method is suitable for the detection of the residual BSA in tissue engineered bone. As the scaffold materials absorb BSA more easily than the cells, the residual BSA in tissue engineered bone is still relatively high. Therefore, new methods of reducing BSA residual need to be explored.

Serum albumin, bovine; Enzyme-linked immenosorbent assay; Tissue engineered bone; Residual

LIU Guang-peng, Email: guangpengliu@163.com

國家自然科學(xué)基金（81171475、31271027）

劉廣鵬，Email: guangpengliu@163.com

2012-12-12

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.002