劉奇，尹磊淼，魏穎，王宇，徐玉東，冉君，楊永清

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蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)方法及原理

劉奇，尹磊淼，魏穎，王宇，徐玉東，冉君，楊永清

200030 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是機(jī)體細(xì)胞的重要組成部分。新生蛋白質(zhì)多肽需要經(jīng)過(guò)翻譯后修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)。翻譯后修飾包括：甲基化、羥基化、羧基化、糖基化、脂?；?、異戊烯基化等共價(jià)修飾[1]。蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在蛋白激酶催化作用下，磷酸基團(tuán)由供體分子轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的含有羥基的氨基酸側(cè)鏈上，具有可逆性[2]。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的全部過(guò)程，文獻(xiàn)顯示在任何時(shí)間內(nèi)真核細(xì)胞蛋白分子中約有 1/3 的數(shù)量在發(fā)生磷酸化[3]，主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，較少見的磷酸化氨基酸還有精氨酸、組氨酸、賴氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸等。蛋白質(zhì)磷酸化氨基酸有 4 種類型：①氧-磷酸鹽，通過(guò)羥氨基酸的磷酸化形成；②氮-磷酸鹽，通過(guò)精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成；③酰基磷酸鹽，通過(guò)天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；④硫-磷酸鹽，通過(guò)半胱氨酸磷酸化形成[4]。

鑒于磷酸化修飾在生命活動(dòng)中所具有的重要意義，探索磷酸化修飾過(guò)程的奧秘及其對(duì)生命活動(dòng)的影響已成為眾多生物化學(xué)家及蛋白組學(xué)家所關(guān)心的內(nèi)容，用蛋白組學(xué)的理念和分析方法研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾，可以從整體上觀察細(xì)胞或組織中磷酸化修飾狀態(tài)及其變化，其中磷酸化修飾蛋白質(zhì)的識(shí)別與檢測(cè)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。

1 常用蛋白磷酸化檢測(cè)方法及原理

1.1 32P 同位素放射性標(biāo)記法

蛋白質(zhì)磷酸化可以通過(guò)識(shí)別電泳凝膠上的同位素蛋白點(diǎn)來(lái)檢測(cè)。用32P 同位素放射性標(biāo)記法，即體內(nèi)代謝培養(yǎng)用32P 同位素放射性標(biāo)記磷酸鹽作為磷酸基團(tuán)供體，經(jīng)過(guò)磷酸化酶促反應(yīng)，帶有32P 同位素放射性標(biāo)記的磷酸基團(tuán)則轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的反應(yīng)蛋白上，通過(guò)凝膠電泳分離，可以用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。但放射性標(biāo)記只能在細(xì)胞中應(yīng)用，比較局限且有放射性危險(xiǎn)。

Arrigo 和 Michel[5]采用32P 同位素放射性代謝標(biāo)記和凝膠電泳分析法，觀察了在耐熱處理后再經(jīng)熱刺激和腫瘤壞死因子刺激的熱休克蛋白 HSP28 磷酸化程度的改變。Aponte 等[6]描述了原位32P 同位素放射性標(biāo)記完整線粒體基質(zhì)蛋白的具體方法，并通過(guò)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察了 40 多種蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，而32P 同位素放射性脈沖追蹤進(jìn)一步揭示了蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的交替，以及磷酸化蛋白質(zhì)成員的變化，該方法不僅顯示了線粒體基質(zhì)磷酸化的豐富，而且有可能提供有生物學(xué)意義的確切的磷酸化位點(diǎn)。Sarkar 等[7]進(jìn)行了甲狀腺激素對(duì)成年大鼠腦突觸蛋白磷酸化作用中鈣調(diào)蛋白的研究。結(jié)果顯示：與鈣離子和鈣調(diào)蛋白所致的磷酸化基礎(chǔ)水平相比，32P 同位素放射性標(biāo)記的突觸磷酸化蛋白在 L-甲狀腺素（L-T3）作用下顯著增多，使用乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）可以明顯抑制甲狀腺激素所致鈣離子和鈣調(diào)蛋白產(chǎn)生的磷酸化影響，提示高比例的 L-T3 所致成年大鼠大腦皮層突觸蛋白磷酸化依賴鈣及鈣調(diào)蛋白的參與。El-Benna 和 Dang[8]分析了人中性粒細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化，應(yīng)用32P 同位素放射性標(biāo)記，在刺激中性粒細(xì)胞蛋白發(fā)生磷酸化之前給細(xì)胞內(nèi) ATP 加入32P 同位素放射性標(biāo)簽，激發(fā)磷酸化后從細(xì)胞中提取蛋白，經(jīng)顯影觀察分析中性粒細(xì)胞蛋白的磷酸化。

1.2 Western blot 蛋白免疫印跡

蛋白質(zhì)磷酸化作用可以通過(guò) Western blot 利用抗磷酸化蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)。Western blot 特異性好、分辨率高，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以一抗為探針，結(jié)合標(biāo)記的二抗并以自顯影或者底物顯色來(lái)顯示蛋白條帶。凝膠由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成。蛋白樣品經(jīng)過(guò)濃縮膠和分離膠后會(huì)以清晰的印跡按分子量大小依次上下排列于膠面上，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜（聚偏氟乙烯膜）或 NC 膜（硝酸纖維素膜），蛋白會(huì)以非共價(jià)鍵的形式穩(wěn)固地結(jié)合在載體上，選擇對(duì)應(yīng)的磷酸化抗體，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的二抗起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性磷酸化蛋白成分。但細(xì)胞中的磷酸化信號(hào)通常比較弱，需要經(jīng)過(guò)磷酸化富集后 Western blot 才能檢測(cè)到，并且由于分析和制備不能用同一塊膠，有時(shí)檢出的蛋白點(diǎn)與膠上的蛋白點(diǎn)很難對(duì)應(yīng)，不利于精確分析[9]。

Kim 等[10]比較了熱休克狀態(tài)和耐熱狀態(tài)下細(xì)胞磷酸化蛋白的差異表達(dá)，共檢測(cè)出 93 種胞內(nèi)蛋白有明顯磷酸化改變，并通過(guò) Western blot、質(zhì)譜等技術(shù)識(shí)別出 81 種磷酸化蛋白。Warters 等[11]通過(guò) Western blot 檢測(cè)射線照射后早期黑素瘤細(xì)胞中全部的磷酸化蛋白質(zhì)，找出了區(qū)別于纖維母細(xì)胞中的異常磷酸化蛋白。Ptak 和 Gregoraszczuk[12]研究了雙酚 A（BPA）對(duì)卵巢癌上皮細(xì)胞 OVCAR-3 瘦蛋白及其受體表達(dá)的影響，通過(guò) Western blot 檢測(cè)評(píng)價(jià)了 BPA、瘦蛋白以及兩者共同對(duì) OVCAR-3 增殖作用中介導(dǎo) JAK/STAT、MAPK/ERK 和 PI3K/AKT 信號(hào)通路磷酸化蛋白活性狀態(tài)，結(jié)果提示，BPA 誘導(dǎo)瘦素受體表達(dá)提供更多的瘦素蛋白結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò) JAK/STAT、MAPK/ERK 和 PI3K/AKT 信號(hào)通路傳遞增殖信息。劉倫華等[13]研究了磷脂酰肌醇-3-激酶（PBK）分別在胰島素所激活 MAPK 通路磷酸化和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）所激活 MAPK 通路磷酸化中的作用，應(yīng)用 Western blot 分析 MAPK 磷酸化通路中磷酸化蛋白水平，結(jié)果提示 PBK 在胰島素和 EGF 刺激的 MAPK 磷酸化信號(hào)通路中起不同的作用。吉非替尼和埃羅替尼是常用肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑的臨床代表藥，韓瑞麗等[14]進(jìn)行了該藥在人非小細(xì)胞癌（NSCLC）EGFR 突變系細(xì)胞 H1650 中耐藥機(jī)制的研究，通過(guò) Western blot 檢測(cè) EGFR 下游 Ras/Raf/MEK/ERK 通路和 PI3K/AKT 通路中 P-AKT 和 P-ERK 蛋白的含量，結(jié)果提示：H1650 細(xì)胞系對(duì)埃羅替尼相對(duì)耐藥可能與 AKT 信號(hào)傳導(dǎo)通路異常活化有關(guān)，而與 Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)途徑無(wú)關(guān)。

Ferlin 等[15]以人成骨細(xì)胞中胰島素樣因子 3（INSL3）為分析對(duì)象，通過(guò)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) MAPK 是 INSL3 誘導(dǎo)信號(hào)通路的主要途徑，并且證實(shí) INSL3 可以調(diào)節(jié)不同成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，提示在骨細(xì)胞代謝中，INSL3/RXFP2 系統(tǒng)通過(guò) MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)刺激成骨細(xì)胞重要基因的轉(zhuǎn)錄。Calegari 等[16]研究運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠胰島細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡標(biāo)記水平的影響，分別提取耐力訓(xùn)練或久坐的對(duì)照組大鼠胰島組織細(xì)胞，通過(guò) Western blot 檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練可能通過(guò)激活 AKT 信號(hào)通路增加胰島 β 細(xì)胞抗氧化能力，減低氧化產(chǎn)物和凋亡蛋白含量，延長(zhǎng)生存時(shí)間。劉蔚然和岳云[17]探討異氟烷麻醉對(duì)術(shù)后老齡大鼠海馬 Tau 蛋白表達(dá)的影響，通過(guò) Western blot 檢測(cè)海馬總 Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白及蛋白磷脂酶的含量變化，結(jié)果表明在正常體溫下，異氟烷并不能誘發(fā) Tau 蛋白的過(guò)度磷酸化，提示異氟烷麻醉誘導(dǎo)的老齡大鼠認(rèn)知功能障礙可能與 Tau 蛋白磷酸化無(wú)關(guān)。

1.3 熒光染色法

Pro-Q Diamond dye 是 Molecular Probes 公司開發(fā)的一種熒光染色試劑，主要用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中蛋白磷酸化的研究，可以直接用來(lái)染色磷酸化蛋白凝膠，檢測(cè)磷酸化位點(diǎn)中的酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸的磷酸化而無(wú)需加入抗體，同時(shí)該染料還與質(zhì)譜兼容，而且不妨礙隨后蛋白質(zhì)組中多種磷酸化分析研究[18]。Pro-Q Diamond dye 對(duì)高豐度且磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化速率低的蛋白質(zhì)具有較高的靈敏度，但對(duì)于不同的磷酸化位點(diǎn)，Pro-Q Diamond dye 的靈敏度差異較大。

Orsatti 等[19]聯(lián)合運(yùn)用二維電泳和 Pro-Q Diamond dye 染色方法，以過(guò)度表達(dá)蛋白酪氨酸磷酸酶 PRL-3 的高度侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT116 為模型，通過(guò) Pro-Q Diamond dye 檢驗(yàn)芯片，成功檢測(cè)出 PRL-3 的兩種目標(biāo)蛋白——細(xì)胞骨架蛋白 ezrin 和延伸因子 2 有明顯的去磷酸化。阿爾茨海默病的特征標(biāo)志之一是海馬區(qū)存在神經(jīng)元纖維纏結(jié)，該結(jié)由異常過(guò)度磷酸化Tau 蛋白組成，Di Domenico 等[20]用Pro-Q Diamond dye 染色方法測(cè)量海馬區(qū)整體磷酸化蛋白的改變，發(fā)現(xiàn) 17 種涉及神經(jīng)元能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常磷酸化蛋白有明顯改變。

Liu 等[21]應(yīng)用雙向凝膠電泳和 Pro-Q Diamond dye 染色技術(shù)對(duì)人體張氏肝臟細(xì)胞總蛋白進(jìn)行了分離，結(jié)果共鑒定出 269 個(gè)磷酸化蛋白。據(jù)此，Liu 等推測(cè)，雙向凝膠電泳結(jié)合 Pro-Q Diamond dye 染色方法可以檢測(cè)全部磷酸化蛋白。Ding 等[22]分析了運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬區(qū)能量代謝和神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的影響。針對(duì)多種蛋白翻譯后修飾及表達(dá)類型，通過(guò) Western blot 和 Pro-Q Diamond dye 染色觀察發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)絲蛋白輕鏈多肽、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、熱休克蛋白 8 和 Pur-α 轉(zhuǎn)錄激活蛋白磷酸化明顯增高，全部上調(diào)蛋白中大多數(shù)涉及認(rèn)知功能，提示運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)能量代謝和突觸可塑性從而促進(jìn)大腦健康。Schulenberg 等[23]應(yīng)用蔗糖密度梯度分離和 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，通過(guò) Pro-Q Diamond dye 分析了牛心臟線粒體蛋白磷酸化穩(wěn)態(tài)，成功得到肽質(zhì)量指紋圖譜，并能區(qū)分相同磷酸多肽不同亞型之間的磷酸化。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)采用熒光標(biāo)記的單細(xì)胞懸液為檢測(cè)樣品，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記熒光的熒光強(qiáng)度來(lái)確定所檢測(cè)細(xì)胞或細(xì)胞因子的濃度[24]。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)熒光標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)特異性抗體可以精確測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)的多參數(shù)磷酸化，可以同時(shí)在不同的細(xì)胞亞群中分析幾種信號(hào)通路組成元件，大大提高了工作量。研究人員可以根據(jù)需要分別檢測(cè)各細(xì)胞亞群的磷酸化水平，從多層次探索信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，且可以同時(shí)分析多種參數(shù)之間的相互關(guān)系[25]。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)需要特異性熒光染料，耗費(fèi)高、儀器貴。

PhosFlow 是一種可用于研究細(xì)胞磷酸化的流式分析技術(shù)。Haas 等[26]比較了 PhosFlow 和 Western blot 檢測(cè)由 CD3 單抗或氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的胞膜近端 TCR 信號(hào)分子磷酸化程度及其磷酸化動(dòng)力學(xué)的差異。兩種技術(shù)皆顯示 CD3 單抗或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的短暫 ZAP70（zeta 鏈相關(guān)蛋白-70）磷酸化都需要酪氨酸激酶的參與。PhosFlow 技術(shù)檢測(cè)提示，與 CD3 單抗誘導(dǎo)的磷酸化相比，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的磷酸化程度較高。Irish 等[27]應(yīng)用 PhosFlow 技術(shù)研究急性髓系白血病，發(fā)現(xiàn)了分別與酪氨酸激酶受體 3 突變、細(xì)胞遺傳學(xué)改變以及與化療反應(yīng)相關(guān)的特異信號(hào)通路特征，并發(fā)現(xiàn)不同癌細(xì)胞亞群之間也存在不同信號(hào)通路。Perl 等[28]采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)急性髓系白血病患者外周血 PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路進(jìn)行連續(xù)監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）被廣泛激活，并發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在 10 ~ 20 nmol/L 劑量時(shí)對(duì) S6 核糖體蛋白磷酸化抑制作用最強(qiáng)，首次提出臨床可以通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)評(píng)估以 PI3K/AKT/mTOR 為靶標(biāo)的藥物的生物化學(xué)效應(yīng)。Berger 等[29]對(duì)纖維素連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）改變 Mo-iDCs（單核細(xì)胞衍生性未成熟樹突狀細(xì)胞）的形態(tài)和功能以及 P38MAPK 和 ERK1/2 信號(hào)通路在該過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng) FN 治療后細(xì)胞基質(zhì)中 P38MAPK 磷酸化高于治療前，而治療前的 ERK1/2 磷酸化強(qiáng)于治療后。許娜等[30]采用流式細(xì)胞技術(shù)研究了伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病中結(jié)合物蛋白（CRKL）的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)伊馬替尼治療后，患者 p-CRKL 蛋白下降水平與遺傳學(xué)緩解情況平行，并提出該方法可成為臨床監(jiān)測(cè)伊馬替尼療效的常規(guī)檢測(cè)手段。

1.5 質(zhì)譜分析法

運(yùn)用質(zhì)譜可以測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目及其位置，是一種可發(fā)現(xiàn)和鑒別翻譯后修飾的方法[31]?；谫|(zhì)譜的蛋白磷酸化分析包括：①識(shí)別磷酸化多肽的存在；②根據(jù)氨基酸序列確定磷酸化類型；③確定磷酸化位點(diǎn)；④在能夠識(shí)別磷蛋白質(zhì)的生物環(huán)境下，實(shí)時(shí)定量確定蛋白磷酸化位點(diǎn)[32]。蛋白磷酸化理論上都可以運(yùn)用質(zhì)譜檢測(cè)，但質(zhì)譜分析酶解磷酸化蛋白并不能檢測(cè)全部蛋白序列，可能會(huì)有重要磷酸化區(qū)域被忽略，且細(xì)胞中磷酸化蛋白含量甚微，磷酸化肽段的信號(hào)容易被非磷酸化肽段的信號(hào)所抑制，所以有必要在質(zhì)譜分析之前進(jìn)行磷酸化蛋白和肽段的富集?，F(xiàn)已建立的富集磷酸化蛋白、肽的方法有：①雙相磷酸多肽譜圖；②高分辨率的凝膠電泳；③反相高效液相色譜；④固定金屬親和色譜；⑤高親和抗體免疫沉淀[33]。

質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)，依據(jù)電離源的不同，可以分為基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜[32]。質(zhì)譜儀首先將蛋白多肽離子化，因質(zhì)荷比不同，多肽在進(jìn)入分析器時(shí)發(fā)生分離，通過(guò)測(cè)量分離肽段離子的相關(guān)參數(shù)，運(yùn)用軟件實(shí)現(xiàn)蛋白鑒定及功能分析[34]。磷酸化蛋白肽段常不穩(wěn)定，在質(zhì)譜中會(huì)由于自發(fā)亞穩(wěn)態(tài)分解或碰撞誘導(dǎo)裂解。利用磷酸酯酶處理后，磷酸化肽段易于丟失 H3PO4或 HPO3，磷酸化絲氨酸或蘇氨酸質(zhì)量數(shù)丟失 98 u，而磷酸化酪氨酸由于磷酸基團(tuán)連接在苯環(huán)上只丟失 80 u[35]。質(zhì)譜利用這些特征可以對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行鑒定。

Mayya 和 Han[36]總結(jié)了近 5 年有關(guān)質(zhì)譜分析磷酸化的研究，分別從內(nèi)容、磷酸蛋白組研究的啟示、應(yīng)用廣度、現(xiàn)有磷酸化蛋白組研究的局限性 4 個(gè)方面進(jìn)行了論述，并且認(rèn)為蛋白質(zhì)磷酸化功能對(duì)建立在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的假設(shè)有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。Jaros 等[37]通過(guò)固定金屬離子親和層析富集技術(shù)和無(wú)標(biāo)記的液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)臨床 80 名志愿者血清中 502 種蛋白內(nèi) 5825 個(gè)磷酸化多肽進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，血清可能是一個(gè)未開發(fā)的磷酸化源，可以用于臨床疾病變化研究、疾病的病理生理機(jī)制探討以及藥物應(yīng)答標(biāo)志物的識(shí)別。Martins-de-Souza 等[38]對(duì) 24 個(gè)嚴(yán)重抑郁癥患者和 12 個(gè)可控制患者死后捐獻(xiàn)的腦組織中背外側(cè)前額葉皮層組織提取物進(jìn)行了分析，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)比較兩者磷酸化蛋白的差異，鑒定出 5195 個(gè)磷酸化多肽，涉及 802 個(gè)非冗余蛋白質(zhì)，兩者結(jié)果比較，90% 的磷酸化蛋白有明顯表達(dá)差異，20% 存在至少 2 個(gè)不同磷酸化肽。Jia等[39]建立了利用氧化鈰納米粒子和等壓串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記標(biāo)簽評(píng)估蛋白磷酸化絕對(duì)化學(xué)計(jì)量的綜合方法，通過(guò)直接測(cè)量已知磷酸化位點(diǎn)的脫磷酸化水平，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)肽和胰蛋白酶消化驗(yàn)證該方法準(zhǔn)確性和精度之后，成功將該方法用于真核起始因子 3H（eIF3H）的定量磷酸化研究。Ruperez 等[40]揭示了絲氨酸和蘇氨酸在人原始 T 細(xì)胞早期 TCR 激活中細(xì)胞骨架重組作用，通過(guò)定量質(zhì)譜分析法并結(jié)合免疫沉淀反應(yīng)和鈦白粉磷酸肽富集等方法共鑒定識(shí)別出 2814 種磷酸肽，激發(fā) 5 min 后絲氨酸和蘇氨酸激酶質(zhì)譜圖像點(diǎn)增多，包含有這些磷酸化位點(diǎn)的蛋白多定位在不同的亞細(xì)胞中，大多參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要涉及細(xì)胞骨架重組和小 GTP 酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，也可能涉及免疫突觸的形成。

1.6 Bio-Plex 懸液芯片

Bio-Plex 懸液芯片系統(tǒng)是美國(guó)伯樂(lè)公司開發(fā)提供的一個(gè)功能強(qiáng)大的芯片技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)整合了軟件包、系統(tǒng)校檢工具、微球體偶聯(lián)試劑和即用型細(xì)胞因子與磷酸化蛋白測(cè)試試劑盒，可在單個(gè)樣品中同時(shí)分析多種生物分子，包括酶底物、受體、抗原或者抗體。經(jīng)過(guò)懸液芯片多重檢測(cè)獲得的數(shù)據(jù)，更有助于從整體揭示生命分子間的相互關(guān)系及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[41]。同步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多重磷酸化蛋白是理解胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，使用懸液芯片技術(shù)可以更加高效地檢測(cè)磷酸化蛋白及其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[42]。但 Bio-Plex 懸液芯片技術(shù)對(duì)于檢測(cè)因子間有交叉反應(yīng)的不能同時(shí)檢測(cè)。

Strehl 等[43]通過(guò) RNA 干擾技術(shù)介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體降低，研究 HEK 293T 細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素膜受體的起源，使用 Bio-Plex 磷蛋白質(zhì)分析技術(shù)和免疫印跡技術(shù)分析糖皮質(zhì)激素膜受體的功能活動(dòng)，結(jié)果表明，HEK 293T 細(xì)胞在經(jīng)過(guò)治療后 P38 MAPK 的磷酸化作用明顯增強(qiáng)。Fujioka 等[44]對(duì)嗎啡阿片受體能激活表皮生長(zhǎng)因子受體從而增強(qiáng)生存信號(hào)進(jìn)行了驗(yàn)證，通過(guò) Bio-Plex 芯片技術(shù)等免疫組學(xué)方法對(duì)人肺癌細(xì)胞中細(xì)胞因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及嗎啡阿片受體和表皮生長(zhǎng)因子受體共表達(dá)區(qū)域進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，嗎啡通過(guò)阿片類受體導(dǎo)致下游 MAPK/ERK、AKT 信號(hào)通路的磷酸化，可以激活表皮生長(zhǎng)因子受體、蛋白激酶 B 的磷酸化。Abadir 等[45]研究了血管緊張素亞型 2 受體和血管緊張素亞型 1 受體的抗炎作用。通過(guò) Western blot 和 Bio-Plex 技術(shù)定量檢測(cè)血管緊張素亞型 2受體的活性、轉(zhuǎn)錄蛋白 3 磷酸化程度以及 TNF-α 的含量，結(jié)果提示血管緊張素亞型 2 受體的高表達(dá)可能通過(guò)降低 TNF-α 的生產(chǎn)和 STAT3 信號(hào)通路活性從而降低炎癥，恢復(fù)血管緊張素亞型 2 受體的表達(dá)或?qū)⑵浼せ睿瑢⒊蔀橹委熝装Y過(guò)程的新靶點(diǎn)。Zhang 等[46]針對(duì)鋅鐵調(diào)控蛋白 4（ZIP4）調(diào)節(jié)胰腺癌生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行了免疫學(xué)驗(yàn)證，通過(guò) Bio-Plex 懸液芯片技術(shù)等方法分別對(duì)細(xì)胞周期蛋白、IL6、和轉(zhuǎn)錄激活劑 3 在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示高表達(dá) ZIP4 通過(guò) cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白增加 IL-6 轉(zhuǎn)錄，IL-6 又激活 STAT3，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白的過(guò)量表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤增長(zhǎng)。

表 1 不同蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

2 小結(jié)

上述方法中，質(zhì)譜法和32P 同位素放射性標(biāo)記法可以用于檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)，確定磷酸化類型；熒光染色和 Western blot 技術(shù)主要檢測(cè)單個(gè)蛋白磷酸化，需要配置相應(yīng)的特異性磷酸蛋白抗體，32P 同位素放射性標(biāo)記也可以檢測(cè)單個(gè)蛋白，但需要配置放射性檢測(cè)儀；流式細(xì)胞技術(shù)可以從細(xì)胞層面檢測(cè)蛋白磷酸化，通過(guò)多染料染色可以同時(shí)測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)的多參數(shù)磷酸化；Bio-Plex 懸液芯片是高通量因子檢測(cè)系統(tǒng)，可以從蛋白水平檢測(cè)多個(gè)蛋白磷酸化也可以從細(xì)胞層面檢測(cè)胞內(nèi)多重蛋白磷酸化而且不局限于單個(gè)細(xì)胞（表 1）。

鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品中相關(guān)蛋白磷酸化修飾是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要部分，雖然已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)磷酸化分析方法，但現(xiàn)有的磷酸化蛋白質(zhì)研究手段尚不能完全滿足對(duì)生物體內(nèi)多種樣品研究的需要，尤其是磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸特異性抗體尚不能完全識(shí)別所有殘基上連接磷酸基團(tuán)的蛋白質(zhì)分子。隨著多種生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，也為了滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的多樣性和復(fù)雜性的需要，進(jìn)行高通量的磷酸化蛋白的相對(duì)定量分析研究已成為必然趨勢(shì)，相信隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)必將得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，為全面和深入地認(rèn)識(shí)生命的復(fù)雜活動(dòng)提供可能。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（81001548、8117334、81173332、81202753）；上海市青年科技啟明星計(jì)劃（12QA1403000）；上海市教育委員會(huì)和上海市教育發(fā)展基金會(huì)“晨光計(jì)劃”資助項(xiàng)目（10CG45）；上海市衛(wèi)生局青年基金（2009Y096）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

楊永清，Email：dryqyang@163.com

2012-12-10

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.010