杜 娟，夏佳楠，沈 麗，王元元，王亞蘋，張德芹

酪氨酸酶(TYR)是皮膚黑色素生物合成的主要限速酶，其化學結構為銅結合糖蛋白。在皮膚黑色素生物合成過程中，酪氨酸羥化生成多巴，多巴氧化生成多巴醌，二羥基吲哚轉化生成吲哚醌，這些反應步驟均需TYR參與，TYR活性與黑色素合成量呈正相關[1]，TYR活性改變可引起色素障礙性皮膚病如白癜風。白癜風好發(fā)于暴露部位而影響美觀，機體酪氨酸酶活性是影響白癜風的主要因素。2005年版《中國藥典》記載，骨碎補、菟絲子外用消風祛斑[2]。本實驗采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測菟絲子、骨碎補提取物對酪氨酸酶活性的影響，為菟絲子、骨碎補外用治療白癜風提供藥效學依據。

1 材料

1.1 實驗儀器 TD-10001電子天平（天津市天馬儀器廠）；Infinite M200微量多功能讀板機TECAN。

1.2 藥物及試劑 菟絲子藥材：購于安徽亳州藥材市場，產地：內蒙，批號201004-1，由天津中醫(yī)藥大學生藥教研室李天祥老師鑒定為旋花科植物菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟種子。骨碎補藥材：購于安徽亳州藥材市場，產地：江西，批號201103-2。由天津中醫(yī)藥大學生藥教研室李天祥老師鑒定為水龍骨科植物槲蕨（Drynaria fortunei Kunze J.Sm.）的干燥根莖。Tyrosinase（批號 #120M700，美國Sigma公司）；柚皮苷標準品（批號110422-200610）；L-DOPA（批號 #080M1712V，美國 Sigma公司）；磷酸緩沖液（批號P1010，北京索萊寶科技有限公司）；甲氧沙林（1g/L，批號2010004，重慶華邦制藥股份有限公司產品）。

2 方法

2.1 試劑及藥物的配制 菟絲子提取物的制備[3]：菟絲子藥材粉碎過100目篩，稱取藥材粉末8g按照1∶14的比例置于112 mL 55%的乙醇中，60℃水浴振蕩提取2次，每次2 h，合并提取液，濃縮，藥渣溶于4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，配成2g/mL的藥液，實驗時稀釋至 2、1、0.5、0.25g/mL 不同濃度。

骨碎補提取物的制備[4]：60%乙醇回流提取3次，濃縮烘干后保存?zhèn)溆?。配制：實驗時稱取骨碎補浸膏200 mg，溶于1 mL的二甲基砜（DMSO）中，配成200 mg/mL 的藥液，用 PBS稀釋至 100、50、25g/L 不同濃度。

柚皮苷標準品：批號110422-200610。配制：精密稱取柚皮苷標準品2 mg，溶于0.2 mL的DMSO中，配成10g/L的溶液。實驗時用PBS釋至400、200、100、50 μg/mL 不同濃度。

L-多巴溶液（10mmol/L）：稱取 197.19mg，用 PBS定容至 100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配（MW：197.19g/mol）。

酪氨酸酶溶液（143 U）：稱取 13.28 mg（25 KU）蘑菇酪氨酸酶（1 881 U/mg），用PBS定容至25 mL，即1 KU/mL。分裝-20℃保存，臨用時室溫平衡，稀釋至實驗所需濃度143 U/mL。

2.2 酪氨酸酶活性的測定 參照文獻[5]方法。以蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法測定酪氨酸酶活性，反應混合物（20 μL 的樣品+70 μL 143 U/mL 的蘑菇酪氨酸酶）37℃溫育 10 min，加入 70 μL 10 mmol/L的L-多巴溶液，2 min后立即于475 nm處測其吸光度，模型組以PBS代替樣品的反應混合物作為模型對照組。每個樣品均設置一個空白對照組，以70μL PBS代替蘑菇酪氨酸酶。

菟絲子的提取物取 2、1、0.5、0.25g/mL 4 種不同濃度；骨碎補提取物取100、50、25g/L不同濃度；柚皮苷標準品取 400、200、100、50 μg/mL 4 種不同濃度。每一個實驗重復3次。

按以下公式計算酶激活率[6]：酪氨酸酶激活率（%）=[（C－D）－（A－B）]/（A－B）×100。其中：A：未加樣品的加酶混合液所測的吸收度；B：未加樣品也未加酶的混合液所測的吸收度；C：加樣品和酶的混合液所測的吸光度；D：加中藥樣品而未加酶的混合液所測的吸光度。

2.3 統(tǒng)計 采用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

見表1、表2。

表1 菟絲子提取物對蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

表1 菟絲子提取物對蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

注：與甲氧沙林組相比，**P<0.01。

組別 濃度（g/mL） 激活率（%）甲氧沙林組 0.001 5.07±0.17菟絲子提取物 2.000 13.14±3.06**1.000 56.07±0.72**0.500 68.22±0.37**0.250 50.09±1.96**

由表1可見，菟絲子提取物的不同濃度對酪氨酸酶活性具有不同濃度的激活作用，且相比于陽性藥甲氧沙林，各濃度菟絲子提取物對酪氨酸酶的激活率均差異有統(tǒng)計學意義，表明，菟絲子提取物具有激活酪氨酸酶活性的作用且優(yōu)于甲氧沙林。

由表2可見，骨碎補提取物和其主要成分柚皮苷均對酪氨酸酶活性具有激活作用，相比于陽性藥甲氧沙林，濃度為200、100g/L骨碎補的提取物和濃度為400、200 μg/mL的柚皮苷標準品差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），結果表明，骨碎補提取物和柚皮苷標準品具有激活酪氨酸酶活性的作用且優(yōu)于甲氧沙林。

表2 骨碎補對蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

表2 骨碎補對蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

注：與甲氧沙林組相比，*P<0.05；**P<0.01。

組別 濃度（g/L） 激活率（%）甲氧沙林組 1.00 5.07±0.17骨碎補提取物 200.00 67.44±17.23**100.00 35.41±6.42**50.00 16.03±1.68 25.00 9.58±3.60柚皮苷標準品 0.40 28.63±0.83*0.20 20.83±2.74*0.10 7.88±1.80 0.05 7.07±1.08

4 討論

作為黑色素合成的關鍵酶，酪氨酸酶活性的異?？赡軐е缕つw色素生成的異常。白癜風是由多種原因引起的色素代謝障礙性疾病，主要原因是由于皮膚黑色素合成減少，其臨床上以皮膚色素脫失斑為特征。由于酪氨酸酶是各種生物體內黑色素形成的關鍵酶，所以能夠激活酪氨酸酶、增強其活性的藥物，可促進黑色素的合成，有助于白癜風病損區(qū)色素的恢復[7]。本實驗選用的陽性藥甲氧沙林的主要成分補骨脂素[8]，補骨脂素已被證實是酪氨酸酶的激活劑，長期用作治療白癜風的藥物[9]。本實驗證明菟絲子、骨碎補提取物體外對蘑菇酪氨酸酶的激活作用明顯強于補骨脂素，提示菟絲子、骨碎補提取物中含有比補骨脂素更強的、作用機制不同的某些化學成分，在此基礎上發(fā)展的新制劑可望有助于白癜風的治療。有關菟絲子、骨碎補等對黑色素生成影響以及治療白癜風的作用機制有待進一步研究。

[1]Iwata M,Corn TIwata S.The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins[J].J Invest Dermatol,1990,95(1):9-15.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學工業(yè)出版社，2005：249－250.

[3]陳林林，吳 春，蔣意橋.菟絲子總黃酮提取工藝的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報（自然科學版），2004，20（6）：644－647.

[4]韋英杰，陳 寧，王 靜，等.正交實驗法優(yōu)選骨碎補提取工藝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2004,15(11):750-751.

[5]Takayuli Hanamura,Eriko Uchina,Hitoshi Aoki.Skin-Lightening effect of a polyphenol extract from acerola(malpighia emarginata DC.)fruit on UV-Induced pigmenta-tion[J].Biosci biochem,2008，72(12):3211-3218.

[6]楊 柳,鄧 艷.紫河車體外對黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響[J].第一軍醫(yī)大學學報，2004，24（9）：1040-1044.

[7]沈 麗，張德芹，黃云英，等.骨碎補外用對實驗性豚鼠白癜風的影響[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2012，31（2）：92－94.

[8]Marwan M M,Jiang J W,Castrucci A M,et al.Psoralens stimulate mouse melanocyte and melanoma tyrosinase activity in the absence of ultraviolet light[J].Pigment Cell Res,1990,3(4):214-221.

[9]黃云英，張德芹.菟絲子外用治療研究進展[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2012，31（3）：190－192.