濮海平，劉 華，呂振華，林榮軍，傅翠捧，孫曉梅

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是全球最常見(jiàn)的慢性疾病，在許多地區(qū)近10～20年哮喘患病率增高了1倍[1]，并有逐年增高的趨勢(shì)。哮喘為慢性氣道炎癥性疾病，長(zhǎng)期的慢性炎癥直接或間接引起氣道重構(gòu)，導(dǎo)致不可逆氣流阻塞，嚴(yán)重影響患者的身心健康。IL-13是近年來(lái)新克隆的Th2型細(xì)胞因子，可通過(guò)募集、歸巢、激活炎性細(xì)胞介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞（EOS）的集聚和氣道高反應(yīng)性（ARH），而在哮喘的發(fā)生中起重要作用。IL-13可不依賴于其它Th2型細(xì)胞因子及嗜酸粒細(xì)胞IgE介導(dǎo)的途徑而單獨(dú)誘發(fā)哮喘的所有癥狀，是哮喘病理發(fā)生中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-13基因多態(tài)性與哮喘的易感性也密切相關(guān)。

盡管目前在哮喘的治療方面已取得了巨大的進(jìn)展，但由于哮喘發(fā)病率的明顯增加，激素抵抗型哮喘的增多、支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用受到其局部和全身不良反應(yīng)的限制。因此有必要探求治療哮喘的新策略。由于IL-13在哮喘病理發(fā)生中的關(guān)鍵作用，因此IL-13是治療哮喘的新目標(biāo)。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者對(duì)IL-13基因多態(tài)性進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)IL-13基因多態(tài)性可能與哮喘間存在著密切的關(guān)系，但具體機(jī)制尚未完全明了。筆者對(duì)哮喘患者及正常對(duì)照組兒童IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)C/T采用限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)位點(diǎn)法（RFL Ps）進(jìn)行了基因多態(tài)性的研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 哮喘組：在解放軍401醫(yī)院及青島醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的漢族患者，符合以下條件者納入試驗(yàn)：患者必須符合文獻(xiàn)[2]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，處于哮喘發(fā)作期，2周內(nèi)未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素，無(wú)共患疾病，年齡 3～12 歲，平均（5.8±2.9）歲，共 96 例。 健康對(duì)照組：為同期健康查體的同齡漢族兒童，平均 （5.6±2.6）歲，均無(wú)哮喘病史，無(wú)家族及個(gè)人過(guò)敏史者共96名。以上受試者間均無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 主要儀器、試劑及樣本采集

1.2.1 主要儀器 水平/垂直板式電泳儀Bio-Rad（USA）；PCR 儀 Eppendorf（Germany）；水平/垂直板式電泳儀 Bio-Rad（USA）；酶標(biāo)儀 ELX-800（USA）；紫外分光光度計(jì)Beckman DU-640（USA）。

1.2.2 主要試劑 EDTA-Na2（上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司）；瓊脂糖Promega；PCR Marker（華美公司）；Taq DNA 聚合酶 Promega；BsaA I限制性內(nèi)切酶 N EB；IgE 試劑盒 （eliza）R＆D；IL-13 試劑盒（eliza）R＆D；引物合成（上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司）。

1.2.3 樣本采集 抽取所有受試者靜脈血3 ml，2%乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA）抗凝，2 ml分離血漿-70℃凍存，1 ml用于取外周血白細(xì)胞基因組 （要求采血至分離白細(xì)胞之間隔時(shí)間在室溫下放置不超過(guò)2 h，4℃放置不超過(guò)5 h，以防白細(xì)胞自溶）。

1.2.4 基因組提取 采用NaI提取法提取外周血白細(xì)胞。取外周抗凝血 （全血）100μl于Ep管中，12 000 r/min離心12 min，棄上清，加雙蒸水200 μl溶解，搖勻 20 s，混勻后加 6M NaI溶液 200 μl，搖勻 20 s，加氯仿/異戊醇（24∶1）400 μl，即加即搖，搖勻 20 s，12 000 r/min 離心 12 min。 取上層液 350 μl，加入另一新Ep管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20 s，室溫放置15 min，靜置后的反應(yīng)體系15 000 r/min離心12 min，使沉淀緊貼Ep管壁。棄異丙醇，加 70%乙醇溶液1 ml（不振動(dòng)），15 000 r/min離心12 min。棄乙醇，敞開(kāi)Ep管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加 1×TE 溶液 30 μl，溶解 DNA＞12 h 以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 血漿IL-13、TIgE的測(cè)定 均采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2 IL-13+1923引物設(shè)計(jì) 引物序列參考文獻(xiàn)[3]：上游引物 5‘-GGACAGGGA CCCACTTCACAC-3’，下游引物 5‘-GCTAACATATTTAATATTTATGT AC-3’。

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng) 該反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，總反應(yīng)體積為 25 μl，80 ng 基因組 DNA，10 mmol/L Tris-HCL （pH8.3），50 mmol/L KCL，1.5 mmol/L MgCl2， 200 μmol/L dNTP， 上下游引物各 50 ng，1.5UTagDNA聚合酶。反應(yīng)過(guò)程：94℃變性2 min，然后 94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，共 33個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min。

1.3.4 IL-13+1923限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)取上述PCR產(chǎn)物10 μl加 BsaA I 5U，37℃酶切過(guò)夜，然后在3%瓊脂糖凝膠上加溴化乙錠（終濃度為0.7 μg/ml），取 8 μl酶切產(chǎn)物在凝膠上上樣電泳，以PCR Markers作為DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)參照物，紫外燈照射下觀察拍照。IL-13+1923位點(diǎn)基因型為：TT基因型出現(xiàn)559 bp 1條帶；CC基因型出現(xiàn)310、249 bp 2條帶；雜合子TC基因型出現(xiàn)559、310、249 bp 3條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用基因計(jì)數(shù)法分別統(tǒng)計(jì)哮喘組和對(duì)照組基因型和等位基因分布頻率，數(shù)據(jù)經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后，用SPSS10.0計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組之間的基因型和等位基因分布頻率顯著性分析用χ2檢驗(yàn)，兩組間IL-13、IgE濃度顯著性分析用t檢驗(yàn)，不同基因型間血漿總IgE濃度比較用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 IL-13基因+1923位點(diǎn)多態(tài)性分析 +1923位點(diǎn)PCR/RFLP結(jié)果見(jiàn)圖1。TC基因型：酶切產(chǎn)物為 559、310、249 bp；CC 基因型酶切產(chǎn)物為 310、249 bp；TT基因型為 559 bp。

圖 1 IL-13+1923位點(diǎn)不同基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)BsaA I酶切分型

2.2 哮喘組與對(duì)照組+1923位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布比較 按文獻(xiàn)[4]對(duì)哮喘組和對(duì)照組的IL-13基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，吻合度測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)的基因型期望值和觀察值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（哮喘組χ2=0.29，P>0.05； 對(duì) 照 組 χ2=0.06，P>0.05）， 符 合 Hardy-Weinberg遺傳平衡。這說(shuō)明所取樣本資料具有代表性、可靠。基因型頻率分布：哮喘組與對(duì)照組比較有顯著性差異（χ2=9.85，P＜0.01），不同的基因型哮喘的患病率，變異等位基因T攜帶者（TT及CT基因型）患哮喘的危險(xiǎn)性高于非攜帶者 （CC基因型）；等位基因頻率分布：兩組之間亦有顯著性差異（χ2=9.27，P＜0.01）。 見(jiàn)表 1。

2.3 IL-13＋1923位點(diǎn)不同基因型對(duì)血漿IL-13及TlgE水平的影響 哮喘組中TT、TC基因型人群IL-13及TlgE水平與同組及對(duì)照組CC基因比較均有顯著性差異（P<0.01），見(jiàn)表 2。

3 討 論

哮喘是一種以EOS浸潤(rùn)為主的氣道反應(yīng)性炎癥和以AHR為特征的疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為，氣道炎癥是哮喘AHR的基礎(chǔ)，而EOS是其關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞[4]。EOS在哮喘氣道的聚集是哮喘發(fā)作的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，EOS的浸潤(rùn)是氣道病理的主要特征。IgE是引起哮喘的主要效應(yīng)分子，IgE結(jié)合許多效應(yīng)細(xì)胞（如肥大細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞等）表面的受體，引起效應(yīng)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，增強(qiáng)黏液分泌和靜脈通透性。IL-13作為Th2型細(xì)胞因子，可通過(guò)EOS炎癥細(xì)胞聚集間接誘導(dǎo)AHR，還可直接誘導(dǎo)AHR。近年來(lái)研究表明，IL-13在誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IgE中也起重要作用，是體內(nèi)僅有的2種可以直接促進(jìn)IgE合成的細(xì)胞因子之一。IL-13誘導(dǎo)EOS在支氣管黏膜層募集，延長(zhǎng)嗜酸性粒細(xì)胞的的壽命，抑制其凋亡，表明IL-13在哮喘的發(fā)生中起到極其重要的作用[5-7]。筆者通過(guò)對(duì)哮喘患者及正常對(duì)照組兒童IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)C/T采用限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)位點(diǎn)法（RFL Ps）進(jìn)行基因多態(tài)性的研究，結(jié)果顯示，+1923位點(diǎn)三種基因型CC、CT和TT及等位基因C、T的頻率分布在所研究的兩組人群中均存在顯著性差異，且T等位基因攜帶者患哮喘危險(xiǎn)性較非攜帶者高約2倍，這說(shuō)明等位基因T與哮喘關(guān)聯(lián)，攜帶T等位基因的個(gè)體具有哮喘易感性。本文結(jié)果還顯示：在哮喘或?qū)φ战M，血漿IgE水平在CC、CT及TT基因型間依次增高，該結(jié)果與這三種基因型個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)性依次增高是一致的，且具有相同基因型的個(gè)體，哮喘患者的IgE水平高于對(duì)照組。這也提示IgE在哮喘發(fā)病中的作用。筆者認(rèn)為，+1923位點(diǎn)不同基因型個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)性不同與該位點(diǎn)不同等位基因所引起的生物學(xué)改變是有一定聯(lián)系的。本文結(jié)果顯示，血漿IL-13水平與IL-13+1923位點(diǎn)C/T基因多態(tài)性有關(guān)，當(dāng)IL-13+1923位點(diǎn)為胞嘧啶（C）時(shí)，血漿IL-13水平較低，說(shuō)明IL-13 mRNA表達(dá)較少；而當(dāng)IL-13+1923位點(diǎn)為胸腺嘧啶（T）時(shí)，血清IL-13水平較高，說(shuō)明IL-13 mRNA表達(dá)較多。這一結(jié)果提示IL-13+1923位點(diǎn)基因多態(tài)性與血清IL-13間存在著密切的關(guān)系。

IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)基因多態(tài)性影響IL-13 mRNA表達(dá)，可能的機(jī)制為：①當(dāng)IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)為胞嘧啶（C）時(shí)，甲基化DNA可直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，而當(dāng)發(fā)生C→T突變時(shí)，這種干擾作用消失，轉(zhuǎn)錄速度將加快，IL-13 mRNA增加，且IL-13 mRNA表達(dá)量將增加[8]；②5-甲基胞嘧啶能與特異性甲基化DNA蛋白結(jié)合，從而阻斷或取代轉(zhuǎn)錄因子的作用，轉(zhuǎn)錄速度下降；如果5-甲基胞嘧啶脫氨基形成胸腺嘧啶（T）時(shí)，則這種阻斷作用消失，因而轉(zhuǎn)錄速度將加快；③內(nèi)含子是高等真核生物基因中主要的非編碼元件，以往曾被認(rèn)為無(wú)重要的功能，但近年來(lái)研究表明，它在RNA剪切過(guò)程中可能有重要的作用。RNA剪切過(guò)程就是精確去除內(nèi)含子，而內(nèi)含子堿基發(fā)生位點(diǎn)突變后，可能造成內(nèi)含子剪切異常，并可能導(dǎo)致基因重組、外顯子重復(fù)或者外顯子再現(xiàn)而提高了特異功能結(jié)構(gòu)域的劑量，這樣可能提高蛋白質(zhì)的活性或使翻譯后剪切產(chǎn)生多個(gè)功能單位而引起劑量效應(yīng)[8]。當(dāng)然IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)轉(zhuǎn)錄及翻譯水平影響的確切機(jī)制尚未完全明了，這有待國(guó)內(nèi)外專家在基因分子水平上做更深入的研究。

表 1 IL-13+1923位點(diǎn)哮喘組與對(duì)照組等位基因頻率分布

表 2 IL-13+1923位點(diǎn)哮喘組與對(duì)照組不同基因型血漿IL-13及總IgE水平（x±s）

目前認(rèn)為哮喘是一種多基因遺傳病，同時(shí)受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響。因此，對(duì)哮喘的治療，至今還沒(méi)有一種很好的方法。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，對(duì)哮喘基因的研究使人們能在基因水平上對(duì)哮喘進(jìn)行治療。應(yīng)用抗IL-13抗體，以阻斷IL-13的作用，或通過(guò)蛋白酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)IL-13的合成，以及應(yīng)用反義寡核苷酸抑制受體的表達(dá)也將可能成為特異性治療哮喘的新的途徑。

[1]楊 昆，黃紹光.支氣管哮喘流行變化趨勢(shì)分析[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（3）:181-183.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組（2004年修訂）.兒童支氣管哮喘防治常規(guī)（試行）[J]. 中華兒科雜志，2004，42（2）:100-106.

[3]Graves P E，Kabeach M，Halonen M，et al.A cluster of seven tightly linked polymorphisms in the IL-13 gene is associated with total serum IgE levels in three populations of white children[J].J Allergy Clin Immutrol，2000，105（3）:506-513.

[4]Menzies Gow A，Robinson DS.Eosinophils，eosinophilis cytokines（interleukin-5）and antieosinophilic therapy in asthma[J].Curr Opin Med，2002，8（1）:33-38.

[5]Crunig W，Warnock M，Wakil A E et al.Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma[J].Science，1998，282（5397）:2261-2263.

[6]Will-Karp M，Luyimbazi J，Xu X，et al.Interleukin-13:central mediator of allergic asthma[J].Science，1998，282（5397）:2258-2261.

[7]Zhu Z，Homer R J，Wang Z et al.Pulmonary experession of interleukin-13 causes inflammation，mucus hypersecretion，subepithelial fibrosis，physiologic abnormalities，and eotaxin production[J].J Clin Invest，1999，103（6）:779-788.

[8]RM.特懷曼著.陳淳等譯.高級(jí)分子生物學(xué)要義[M].北京：科學(xué)出版社，2000.86-87.