保健酒違法添加奧沙普嗪免疫學(xué)檢測方法建立

郭杰標(biāo)，李杏娉，郝卿辰，鐘瑞敏，何穎娟，劉艷珊

（韶關(guān)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

非甾體抗炎藥物治療風(fēng)濕性疾病起效迅速且價(jià)格低廉，近期不斷發(fā)現(xiàn)有不法廠家在保健酒中違法添加這類藥物，以增強(qiáng)療效牟取不正當(dāng)利益[1-2]。違法產(chǎn)品對消費(fèi)者的健康造成危害，服用后可能產(chǎn)生惡心、頭痛或過敏性皮疹等不良反應(yīng)，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致過敏性休克和急性腎功能衰竭[3-7]。

目前，檢測違法添加非甾體抗炎藥物的主要方法是高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用檢測[8-11]和薄層色譜法[12-13]。但是這些方法設(shè)備投入大、運(yùn)行費(fèi)用高、樣品預(yù)處理復(fù)雜，難以大規(guī)模開展檢測。本研究開發(fā)非甾體抗炎藥物奧沙普嗪酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測方法，為大規(guī)模的專項(xiàng)打假工作提供靈敏、特異、快速和價(jià)廉的篩查工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

新西蘭大白兔：南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要藥品及試劑

奧沙普嗪標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；弗氏完全（不完全）佐劑、牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自上海生工；山羊抗兔IgG 二抗酶結(jié)合物：Jackson；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

96 孔酶標(biāo)板：Nunc 公司；紫外/可見光掃描儀：美國Thermo 公司；酶標(biāo)儀：Labsystems 公司。高效液相色譜為Agilent 1100 型（Kromasil C18 柱4.6 mm×250 mm，P/N 07251967）。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成

稱取1.0 mg 奧沙普嗪溶解于1.0 mL 四氫呋喃中，再加入2.0 mg NHS 和3.0 mg DCC，室溫反應(yīng)24 h，10 000 r/min 離心15 min 去除沉淀，取上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到活化產(chǎn)物。

活化產(chǎn)物溶解于0.5 mL 二甲基亞砜中，緩慢滴入BSA 溶液中（15 mg 溶于2 mL 0.15 mol/L NaHCO3）。25 ℃振蕩反應(yīng)4 h，得到奧沙普嗪免疫抗原。同樣方法，與OVA 反應(yīng)得到奧沙普嗪檢測抗原。反應(yīng)完全后，蛋白溶液用0.01 mol/L PBS（pH7.4）溶液充分透析，用紫外掃描判斷偶聯(lián)結(jié)果。

1.2.2 奧沙普嗪人工抗原偶聯(lián)比的計(jì)算

奧沙普嗪在280 nm 處有特征吸收，測定奧沙普嗪濃度消光系數(shù)K280，則人工抗原中奧沙普嗪的濃度：Con.奧沙普嗪=（A280人工抗原－A280載體蛋白）/K280；用雙縮脲法檢測載體蛋白質(zhì)量濃度，計(jì)算奧沙普嗪的人工抗原偶聯(lián)比R。

式中：M奧沙普嗪是奧沙普嗪的摩爾質(zhì)量；M載體蛋白是載體蛋白的摩爾質(zhì)量。

1.2.3 動物免疫

將與BSA 偶聯(lián)成功的免疫原免疫新西蘭雄性大白兔。首次免疫，取200μg 免疫抗原與弗氏完全佐劑乳化，采用背部多點(diǎn)免疫健康大白兔。首次免疫后4周，然后每間隔3 周，取免疫抗原100 μg 與弗氏不完全佐劑乳化加強(qiáng)免疫4 次。最后一次免疫8 d 后心臟取血，血液在4 ℃條件下放置過夜，5 000 r/min 離心10 min，保留血清，并加入等體積的甘油存放于-20 ℃的冰箱中。

1.2.4 血清效價(jià)測定

參照Li 等[14]報(bào)道的方法，采用間接ELISA 測定免疫兔血清的抗體的效價(jià)。

1.2.5 最佳檢測條件的確定

參照Wang 等[15]報(bào)道的方法，通過棋盤滴摸索最佳抗原包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)：檢測抗原按2.0、5.0、10、15 μg/mL 的濃度包被酶標(biāo)板，抗血清分別按1.5×105、2.0×105、3.0×105、4.0×105倍稀釋，每種抗原/抗體工作組合形成的檢測體系，分別檢測奧沙普嗪濃度為0 和20 ng/mL 的兩種溶液，按公式（2）計(jì)算抑制率（I%）。I%最大而且A0值在1.3～1.6 之間的孔，所采用的抗原/抗體工作組合就是最佳檢測條件。

式中：Ai是加入奧沙普嗪抑制的檢測值，A0未加入奧沙普嗪抑制的檢測值，AB是未加入抗體的空白檢測值。

1.2.6 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.4 摸索的最佳檢測條件，用奧沙普嗪系列濃度10、3.0、1.0、0.3、0.1 ng/mL 進(jìn)行競爭抑制ELISA檢測。以奧沙普嗪標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度為橫坐標(biāo)、A450值為縱坐標(biāo)，用RIDAWIN 軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.7 交叉反應(yīng)率的測定

以ELISA 方法檢測8 種相關(guān)的抗炎藥品（吲哚美辛、舒林酸、布洛芬、萘普生、雙氯芬酸、阿司匹林、美洛昔康、酮布芬），計(jì)算各相關(guān)藥物的50%抑制濃度（IC50值）。交叉反應(yīng)率（Cross-reactivity，CR）的計(jì)算式為：

1.2.7 樣品檢測

取0.2 mL 樣品溶解在20 mL PBS 溶液中，然后取0.2 mL 樣品制備液溶解在20 mL 樣品緩沖液（0.01 mol/L PBS，pH7.4，0.05%Tween-20，0.2%BSA）中，樣品被稀釋了10 000 倍。按照1.2.5 的步驟進(jìn)行ELISA 檢測，將檢測數(shù)值內(nèi)插到標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品溶液奧沙普嗪的濃度，在乘以稀釋倍數(shù)就是樣品中奧沙普嗪的含量。

1.2.8 HPLC 比對驗(yàn)證

按照李存金[6]等報(bào)道的方法，以甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH3.3）（66 ∶34）為流動相，在流速1.0 mL/min、檢測波長263 nm 的條件下，檢測1.2.7 步驟檢測過的保健酒中奧沙普嗪的含量，與ELISA 檢測結(jié)果進(jìn)行比對驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

人工抗原的鑒定如圖1 所示。

圖1 人工免疫抗原、載體蛋白和雙氯芬酸紫外掃描圖譜Fig.1 UV absorption spectra of artificial immunogen、carrier protein and oxaprozin

奧沙普嗪-BSA 偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜，與各自的BSA 載體蛋白明顯不同，在奧沙普嗪吸收峰230、280 nm 處吸光光度值明顯增強(qiáng)，說明奧沙普嗪與BSA偶聯(lián)成功。奧沙普嗪-OVA 偶聯(lián)物掃描圖譜同樣證明奧沙普嗪與BSA 偶聯(lián)成功。

根據(jù)1.2.2 中的公式（1），計(jì)算得到免疫抗原的奧沙普嗪/載體蛋白偶聯(lián)比為9.6，檢測抗原的奧沙普嗪/載體蛋白偶聯(lián)比為3.2。

2.2 血清效價(jià)測定

檢測2 只家兔稀釋3.2×106倍血清的A450值大于0.300，奧沙普嗪特異性抗體的滴度符合要求。

2.3 最佳檢測條件的確定

以棋盤實(shí)驗(yàn)，摸索最優(yōu)抗原/抗體工作濃度，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同抗原/抗體濃度組合下的Ai/A0值Table 1 Ai/A0valuess under different concentration combinations of antigen/antibody

當(dāng)檢測抗原包被濃度為5.0 μg/mL，抗血清稀釋3.0×105倍條件下，檢測5.0 ng/mL 奧沙普嗪樣品溶液，產(chǎn)生的抑制率達(dá)到最高，以此條件構(gòu)建ELISA 檢測體系。

2.4 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.5 方案進(jìn)行競爭抑制ELISA 檢測，奧沙普嗪濃度對抑制率的ELISA 曲線如圖2 所示，回歸方程Y=63.6-45 log（X）（R2=0.988 6），IC50值為3.1 ng/mL。

圖2 奧沙普嗪ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 ELISA standard curve of oxaprozin

設(shè)定檢測閾值為I%=25%，內(nèi)插到標(biāo)準(zhǔn)曲線，奧沙普嗪最低檢出濃度為0.5 ng/mL。

2.5 交叉反應(yīng)率的測定

抗體對不同藥物的交叉反應(yīng)，如表2 所示。

表2 抗體對不同藥物的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivities of the antibodies against 8 associate drugs

由表2 可知，檢測8 種相關(guān)藥物與抗體的交叉反應(yīng)率結(jié)果都小于0.05%，證明檢測所有抗體的特異性良好。

2.6 樣品檢測與驗(yàn)證

分別使用ELISA 和HPLC 對30 個市售保健酒樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表3 所示，證實(shí)兩種方法的檢測結(jié)果有很高的吻合度。

表3 30 個保健酒樣品的ELISA 和HPLC 檢測結(jié)果Table 3 Determination results of 30 health liquors using ELISA and HPLC

3 結(jié)論

本研究使用活潑酯法制備了奧沙普嗪人工抗原，通過動物免疫獲得了抗奧沙普嗪抗體，所建立ELISA檢測方法IC50值為3.2 ng/mL，最低檢測限為0.5 ng/mL。與8 種相關(guān)藥物交叉反應(yīng)率都小于0.1%，檢測30 市售保健酒樣品的結(jié)果與HPLC 完全吻合。

本免疫檢測方法靈敏度和特異性滿足于檢測保健酒中的非法添加的奧沙普嗪，能夠?yàn)槭称匪幤钒踩珜ｍ?xiàng)檢查提供方便的篩查工具。

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