T-2毒素膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制

徐小婧，王俊平，王霄雪，談超，王碩，張燕

（天津科技大學食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457）

T-2 毒素為白色針狀結晶，熔點150 ℃～151 ℃，難溶于水，易溶于極性溶劑，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。烹調過程不易將其破壞。分子式為C24H34O9，分子量為466?；窘Y構為四環(huán)的半倍萜，C-9 和C-10 位上有不飽和雙鍵，在紫外燈下不顯熒光。

T-2 毒素（T-2 toxin）是真菌毒素之一，屬于單端孢霉烯族化合物中的A 族。是該類化合物中毒性最強的毒素之一。在近年來被確定為大骨節(jié)病、食物中毒性白細胞缺乏癥的致病因子。毒性分級為劇毒，有明顯的細胞毒和對蛋白質、DNA 合成的抑制作用，并有肯定的致畸性和致突變性[1-2]。主要污染小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥等谷物及麥芽、啤酒等食品，在美洲、歐洲等各洲的谷物中廣泛存在，國內報道在大骨節(jié)病病區(qū)小麥和玉米中均有檢出[3]。目前國際上對T-2 毒素制訂的限量標準不多，前蘇聯(lián)等多國規(guī)定在糧食中允許標準為100 μg/kg[4]。

有關T-2 毒素的檢測方法等的研究，國內外開展的比較多。目前，檢測糧谷類食品和飼料中T-2 毒素的方法主要有薄層色譜法（TLC）、液相色譜法（LC）、氣相色譜法（GC）、氣質聯(lián)用（GC-MS）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）等。傳統(tǒng)分析方法需要昂貴的儀器，對技術人員要求高，樣品需經(jīng)過繁瑣的前處理，成本高，分析速度慢，很難達到快速、簡便和現(xiàn)場檢測要求，更難以適應大量復雜樣品的檢測。而膠體金免疫層析方法具有簡便快速、靈敏直觀、無需儀器等特點，因此被廣泛地應用于快速檢測，臨場檢測等領域。但采用膠體金免疫層析法快速半定量測定T-2 毒素少有報道。本試驗根據(jù)膠體金免疫層析試驗（GICA）原理成功研制出T-2 毒素膠體金免疫層析快速檢測試紙條，建立了一種快速、有效的T-2 毒素檢測方法，現(xiàn)將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

T-2 毒素（T-2 toxin）、卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白（BSA）、琥珀酸酐（HS）、二甲基酰胺（DMF）、二抗（羊抗兔）：Sigma 公司；抗T-2 毒素兔多克隆抗體：天津科技大學食品營養(yǎng)與安全重點實驗室免疫純化得到；氯金酸（HAuCl4）：Acoros 公司；檸檬酸三鈉：Fluka 公司；聚乙二醇（PEG20000）：Biobasic 公司；Millipore 硝酸纖維素膜H180（NC 膜）、玻璃纖維膜、PVC 底板、吸水紙均購自上海金標生物科技有限公司；甲醇、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉：天津化學試劑六廠；磷酸鹽緩沖液PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）。

旋蒸儀：瑞典Buchi 公司；超純水系統(tǒng)：美國Millipore 公司；低溫高速離心機：德國Eppendorf 公司；雙維平面華劃膜儀、全自動斬切機：上海金標生物科技有限公司；真空干燥箱：三水公司。

1.2 方法

1.2.1 T-2 毒素完全抗原的制備

1）半抗原的合成參考Chu[5]的方法：取5 mg T-2毒素溶于1 mL 無水吡啶中，加入105 mg 琥珀酸酐，在油?。?05 ℃）的條件下反應4 h。反應物減壓干燥后溶于氯仿，水洗4 次。氯仿層旋干，即得到T-2 HS 結合物。

2）T-2 HS 結合物與載體蛋白的連接采用活化酯法[6]：稱取5 mg T-2 HS 與1.27 mg N-羥基琥珀酰亞胺溶于1 mL 無水四氫呋喃中，在氮氣保護下加入2.27 mg N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺，室溫，反應過夜。反應物在相對離心力450 g，離心15 min。取上清液旋干。得到活化酯，質譜鑒定產(chǎn)物。

3）稱取5 mg OVA 溶于1 mL 磷酸氫二鉀緩沖液（50 mmol/L K2HPO4，pH 9.3）中，取制備的活化酯溶液90 μL 緩慢滴加到蛋白緩沖液中，過程要在冰浴中進行，滴加完畢后放入4 ℃冷藏柜反應過夜，取出后在室溫下放置1 h～2 h，將連接液裝入透析袋，用PBS 溶液透析3 d，每天換3 次。收集透析后液體加入10 μL 的0.01 mg/L 的疊氮鈉，分裝后-20 ℃保存。

1.2.2 膠體金的合成與表征

取100 mL 氯金酸溶液（1.0×10-4g/mL）置于250 mL的錐形瓶中，在磁力攪拌的同時加熱至沸騰，沸騰后迅速加入檸檬酸鈉水溶液（濃度為0.01 g/mL）2 mL，5 min之內顏色變化并且穩(wěn)定，后繼續(xù)加熱15 min，之后移去熱源，室溫放置至冷卻，最后用去離子水補充失去的水分，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1）肉眼觀察：用肉眼觀察所制得的膠體金溶液，觀察其顏色、均勻度和透明度。

2）可見光光度法：用紫外可見光分光光度儀對膠體金在紫外可見光范圍內（200 nm～600 nm）進行掃描，獲得膠體金紫外可見光吸收光譜，測定最大吸收波長、吸光值和峰寬。

3）掃描電鏡：在掃描電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無不規(guī)則形狀。拍片放大后測量膠體金顆粒直徑大小，取多個點計算膠體金顆粒的平均直徑（由天大科技園完成）。

1.2.3 膠體金標記抗體蛋白

因為膠體金是膠體，所以當含有電解質時會造成膠體金的聚沉，所以應該盡量保證抗體中較低的含鹽量，這樣標記前抗體必須徹底除鹽，將待標記的T-2毒素多克隆抗體置入透析袋中在雙蒸水或極低濃度的鹽水（5 mmol/L NaCl，pH 7.0）中4 ℃透析過夜，除去多余的鹽離子[7]。

量取10 mL 膠體金溶液，將pH 調至8.5，在攪拌狀態(tài)下向其中逐滴加入200 μL 濃度為1 mg/mL 的除鹽抗體，保持攪拌1 h，加入200 μL 濃度為0.2 g/mL BSA 水溶液及100 μL 濃度為0.1 g/mL PEG20000 水溶液作為穩(wěn)定劑，繼續(xù)攪拌0.5 h。

1.2.4 金標記抗體的純化及表征

在4 ℃低溫下，先2 000 r/min 低速離心15 min，吸取上清液；然后將所得上清液以12 000 r/min 高速離心30 min，仔細吸出上清；底層紅色液體用金標儲存液重懸為原體積1/10，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將與抗體標記的膠體金溶液與未標記的膠體金溶液在紫外下進行全波長掃描，觀察波形變化，判斷是否標記成功。

1.2.5 層析條件的優(yōu)化

1）分別對二抗、包被原、金標抗體的包被量進行優(yōu)化。

2）對包被原稀釋液及包被條件進行優(yōu)化。

3）對金標墊的干燥方式、金標墊泡墊配方及封閉NC 膜的封閉液做優(yōu)化。

1.2.6 試紙條的組裝

將樣品墊、金標墊、已包被好抗原抗體的NC 膜、吸水紙依次粘貼到PVC 底板上，切割成條，用封口袋密封，置于干燥器中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 試紙條的檢測方法與最低檢測限的確定

將試紙條插入樣品液中，待樣品液浸潤金標墊后取出平放10 min 后觀察。如果檢測線、質控線上均出現(xiàn)紅色條帶，說明樣品呈陰性；如果只有質控線上出現(xiàn)紅色條帶說明樣品呈陽性；如果質控線上無條帶，說明試紙條失效。

用甲醇稀釋T-2 毒素標準品至10 mg/L，然后用優(yōu)化好的標品稀釋液分別稀釋濃度至5、10、50、100、200 ng/mL，并設一個空白陰性對照，插入試紙條，10 min判定結果，每個濃度重復6 次。取質控線剛好消失的濃度為最低檢測限。

1.2.8 試紙條的穩(wěn)定性與重復性確定

取同批次試紙條分別置于4 ℃與37 ℃作7 d 對照試驗，每個濃度重復做3 次。取不同批次及批間的試紙條作對照試驗，每個濃度重復3 次。

2 結果與分析

2.1 膠體金的合成與質量鑒定

膠體金的制備過程和膠體金探針的標記是獲得可靠結果的關鍵，在其膠體金制備的過程當中應特別注意用于制備膠體金的玻璃器皿必須非常清潔，特別要防止油脂污染，這是因為玻璃表面性狀對還原過程的成功與否有重要作用，如果有少量的污染就會影響金顆粒的生成，造成顆粒大小不一或液體混濁。所制備的膠體金溶液如出現(xiàn)渾濁、聚集、沉淀、顆粒不均，都是不符合標記的標準的[8]，一概不能使用。檸檬酸鈉還原法是合成膠體金的經(jīng)典方法，膠體金顆粒尺寸、粒徑分布、晶體結構和分散度都受到反應動力學的影響，而影響反應動力學的因素又包括還原劑的用量、反應溫度、pH 等[9]。本實驗通過篩選最終選擇20 nm 的膠體金作為標記物。

用肉眼觀察，可見膠體金溶液外觀呈深紅色，色澤均勻清亮，表面沒有漂浮物。膠體金溶液500 nm～600 nm 的紫外可見光掃描圖譜如圖1。

由圖1 可知，只有一個最大的吸收峰λmax=520 nm，最大吸收峰峰值為1.625，而且制備的膠體金溶液峰寬較小，波形光滑，說明制得的膠體金溶液的顆粒大小比較均勻。

圖2 為膠體金的掃描電鏡圖。

圖1 膠體金的可見光吸收光譜Fig.1 Visible-light absorbance spectrum of colloidal gold

圖2 膠體金電鏡掃描圖（Bar=100 nm）Fig.2 Determination of colloidal gold by scanning electron microscope

由圖2 可知，可以觀察到膠體金顆粒粒徑比較均一，且無橢圓形和多角形的金顆粒存在，放大后取多點測量膠體金粒徑為20 nm。

2.2 金標抗體的質量鑒定

將與抗體標記的膠體金溶液與未標記的膠體金溶液在紫外下進行全波長掃描，結果見圖3，上面的峰為標記后的膠體金溶液在紫外下的吸收峰，下邊的峰為未標記的膠體金溶液在紫外下得吸收峰。

圖3 紫外可見掃描抗體標記膠體金Fig.3 Ultraviolet light absorbance spectrum of colloidal gold labeled with T-2 toxin Ab

由圖3 可見，膠體金溶液在紫外下進行全波長掃描，得到最大的吸收波長是520 nm，膠體金標記了T-2毒素多克隆抗體后，其最大吸收峰出現(xiàn)了位移，在540 nm 處波長出現(xiàn)，有此判斷抗體已經(jīng)標記上了膠體金。

2.3 層析條件的確定

1）對二抗稀釋倍數(shù)、包被原稀釋倍數(shù)、金標抗體稀釋倍數(shù)做正交試驗優(yōu)化，最終確定三者所用的稀釋倍數(shù)分別為1 ∶600、1 ∶1、1 ∶20。

2）由于T-2 毒素微溶于水，易溶于有機溶劑。在包被原稀釋液中加入一定量的甲醇有利于包被原與NC 膜更穩(wěn)固的結合。最終優(yōu)化用3%的甲醇PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）溶液稀釋包被原包被于NC 膜上。為了縮短包被時間，采用了烘箱37 ℃包被1 h。

3）金標墊經(jīng)噴金后分別放于室溫、37 ℃鼓風烘箱、37 ℃真空干燥箱進行干燥，最終37 ℃真空干燥箱干燥效果最好，金標抗體釋放完全。在金標抗體釋放過程中，蔗糖與BSA 的加入可以起到整體增色的效果，Tween20 等表面活性劑的加入可以加速金標抗體的釋放速度，所以采取10%蔗糖，5%BSA，0.1%Tween 20，0.1%NaN3的金標墊泡墊配方，在噴金前預先泡墊。同時為盡量減少NC 膜的非特異性吸附選用含1 %BSA 的PBS 緩沖液對NC 膜進行封閉。

2.4 最低檢測限的確定

采用已優(yōu)化好的條件，制備好免疫層析試紙條測定T-2 毒素的最低檢測限，結果見圖4。

圖4 T-2 毒素檢測限的確定Fig.4 Assay sensitivities for T-2 toxin

如圖4 所示，T-2 毒素標品濃度為50 ng/mL 時質控線恰好消色，此即為試紙條方法的最低檢測限。

2.5 方法檢測的特異性

將HT-2 毒素，赭曲霉毒素A，伏馬毒素B1，黃曲霉毒素B1等溶于含3%甲醇的PBS（pH 7.4，0.01 mol/L），配成1 000 ng/mL 濃度，然后用檢測試劑檢測。結果表明，本檢測試劑與以上物質在1 000 ng/mL 濃度時沒有交叉反應。因此本檢測試劑可以通過觀察試劑上檢測線的有無及顏色變化進行定性檢測，對T-2 毒素具有較高的特異性。

2.6 重復性及穩(wěn)定性的確定

隨機抽取不同批次和批間制備的試紙條進行重復檢測實驗，檢測結果基本一致。說明該方法重復性好。

采用加速試驗進行穩(wěn)定性研究，37 ℃保存7 d 相當于4 ℃保存6 個月[10]。研究發(fā)現(xiàn)，膠體金標記抗體在37 ℃保存4 d 后，試紙條的質控線顏色明顯變淺，檢出限降低至25 ng/mL，說明金標抗體在3 個月的保存期內穩(wěn)定性較好。

3 結論與展望

目前，食品中T-2 毒素的檢測方法很多，但各有其優(yōu)缺點。本試驗研制的T-2 毒素免疫層析試紙條靈敏度高、重復性較好，具有檢測快速，操作簡單，無需專業(yè)人員或儀器檢測，目測即可觀察結果，適用于快速檢測及臨場檢測。

分析穩(wěn)定性較差的原因可能是因為T-2 包被原在儲藏的過程中T-2 毒素從大蛋白分子上脫落，這是由于T-2 毒素連接蛋白分子的結構不穩(wěn)定，可進一步選用其他更好的接臂方式制備半抗原連接蛋白做包被原?？蛇M一步將T-2 毒素試紙條應用于實際樣品的檢測中。

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