冉 昇，孫惜時(shí)，任 嬌，信亞偉，崔桂友

(揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院營(yíng)養(yǎng)系，江蘇揚(yáng)州 225127)

隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，絲狀真菌的原生質(zhì)體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和遺傳育種等諸多領(lǐng)域，尤其應(yīng)用于原生質(zhì)體制備、誘變技術(shù)進(jìn)行菌種改良，為進(jìn)一步研究微生物生理活性提供了有利條件。在生物催化技術(shù)日新月異的今天，絲狀真菌以其在抗生素、酶制劑等多方面所具有的廣泛應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景，正不斷成為微生物催化技術(shù)所研究的新焦點(diǎn)，并可能成為具有產(chǎn)生巨大潛在食品醫(yī)藥價(jià)值的新穎化合物能力的微生物類群［1］。作為1株具有潛在生物催化能力的疑似菌株，研究表明皮殼青霉(Penicillium crustosum)具有獨(dú)特的生物轉(zhuǎn)化能力［2-3］，然而關(guān)于該菌株是否存在特異性的代謝酶系的結(jié)果不得而知。原生質(zhì)體的制備作為研究代謝酶系不可缺少的基礎(chǔ)顯得日益迫切，但目前暫無(wú)關(guān)于該菌株原生質(zhì)體的研究報(bào)道。本文對(duì)皮殼青霉原生質(zhì)體制備和其形成釋放方式進(jìn)行了初步研究，為通過(guò)原生質(zhì)體進(jìn)行菌種內(nèi)部酶系的檢測(cè)和分析研究、菌種誘變改良以及遺傳操作等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 皮殼青霉(Penicillium crustosum)，本實(shí)驗(yàn)分離于土壤并鑒定后的保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 真菌斜面保藏培養(yǎng)基:PDA;真菌發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，K2HPO45 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

1.1.3 主要藥品與試劑 溶壁酶(Lywallzyme)，廣東微生物制品研究所;二硫蘇糖醇(DTT)，阿拉丁試劑公司;PDA無(wú)水培養(yǎng)基，上?？翟瓷?蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶壁酶及其配置 精確稱取溶壁酶粉，添加一定體積的酶解用磷酸緩沖液［4］，冰浴配制成所需濃度的原生質(zhì)體酶解液。酶解液使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，封口冰浴放置備用。

1.2.2 菌體材料制備 取新鮮培養(yǎng)4 d的斜面菌種1支，配成濃度約為4×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。接種0.5 mL孢子懸液于裝液量為50 mL新鮮真菌發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中，28℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，獲得大小均一的菌絲球。8層紗布過(guò)濾獲得菌絲球，并用無(wú)菌水洗滌3次待用。

1.2.3 原生質(zhì)體制備 無(wú)菌選取大小均一，直徑約為0.5 cm的菌球，瀝干水分置于2 mL Eppendorf離心管中(1球1管)。離心管中加入現(xiàn)配原生質(zhì)體酶解液500 μL，使菌球懸浮于酶解液中，封口膜封口。恒溫水浴酶解，每30 min渦旋1～2 s以助酶解。

1.2.4 原生質(zhì)體顯微觀察 取菌體原生質(zhì)體酶解液，即時(shí)制片用以觀察和鏡下計(jì)數(shù)(25×16規(guī)格血球計(jì)數(shù)板)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 不同酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 不同真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分存在差異，選擇合適的裂解酶制備原生質(zhì)體是合理實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。作為一種復(fù)合型水解酶，溶壁酶具有簡(jiǎn)潔快速高效穩(wěn)定等特點(diǎn)并且更適合青霉屬真菌的原生質(zhì)體制備［5-6］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，酶解實(shí)驗(yàn)中原生質(zhì)體的產(chǎn)量普遍呈現(xiàn)了先升高后降低的整體趨勢(shì)。其中10 mg/mL的酶濃度效果較好，3 h時(shí)10 mg/mL和20 mg/mL酶濃度的作用效果大致相同，但是在酶解4 h時(shí)，10 mg/mL酶濃度作用效果出現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢(shì)，且各濃度產(chǎn)量均有一定增加。同時(shí)考慮到作用效果和經(jīng)濟(jì)因素等條件，本實(shí)驗(yàn)選擇10 mg/mL作為最佳酶濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different lywallzyme concentrations on protoplast production

圖2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different enzymolysis time on protoplast production

2.1.2 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體的重要因素，較短的酶解時(shí)間能使原生質(zhì)體保持較高的活性，但不能保證其充分釋放［7］;但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將極大影響原生質(zhì)體的整體活性和穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致其膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷破裂。如圖2所示，5個(gè)濃度梯度酶解作用下的原生質(zhì)體產(chǎn)量總體都呈現(xiàn)了隨著酶解作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加的趨勢(shì)。適宜的酶解時(shí)間有利于在保證較高水平原生質(zhì)體釋放量的情況下進(jìn)一步保證其活性質(zhì)量，研究表明酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(大于4 h)會(huì)使青霉屬菌原生質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)受到損傷，且影響原生質(zhì)體的整體質(zhì)量［4］，同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)的連續(xù)取樣觀察中發(fā)現(xiàn)，在酶解作用5 h時(shí)菌絲幾乎全部瓦解，原有釋放的原生質(zhì)體可能會(huì)因酶解作用導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破損，從而導(dǎo)致原生質(zhì)體質(zhì)量下降。因此綜合選擇4 h作為最適酶解時(shí)間。

2.1.3 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響溶壁酶具有一定的酶解溫度使用參數(shù)(高于26℃，低于35℃)，實(shí)驗(yàn)選用26、28、30、32和34℃5個(gè)梯度進(jìn)行制備考察。

圖3 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis temperatures on protoplast production

如圖3所示，26～32℃的溫度范圍內(nèi)，28℃的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，但34℃時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量較28℃時(shí)顯著提高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然26～32℃的溫度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量變化不規(guī)律，但是從酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量增長(zhǎng)速率的影響角度出發(fā)，可以發(fā)現(xiàn)是存在一定規(guī)律的(見圖4)，即在26～34℃的溫度范圍內(nèi)，溫度越高越有利于菌體產(chǎn)生原生質(zhì)體，溫度越高原生質(zhì)體釋放達(dá)到最大產(chǎn)量的時(shí)間越短，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與擴(kuò)展青霉K40的原生質(zhì)體制備結(jié)果吻合［8］。但是綜合原生質(zhì)體制備的其他情況，選取34℃作為最佳酶解作用溫度，此時(shí)溶壁酶能夠更好地發(fā)揮酶解作用。

圖4 各酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成速率的影響Fig.4 Effection rate of different enzymolysis temperatures on protoplast production

2.1.4 不同前處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 原生質(zhì)體制備的預(yù)處理方法主要集中于化學(xué)法而非物理法。許多研究表明，在酶解前或酶解過(guò)程中加入一些化學(xué)試劑(如巰基乙醇和二硫蘇糖醇［5，9-11］)，存在增加菌體原生質(zhì)體釋放的有利效果［12］。劉志成等［13］在對(duì)擴(kuò)展青霉原生質(zhì)體的制備研究時(shí)，對(duì)在菌體酶解前和酶解中添加化學(xué)試劑2種處理方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示化學(xué)處理劑預(yù)先處理菌體再用于酶解效果更優(yōu)。然而在化學(xué)預(yù)處理劑的選擇上，巰基乙醇并不適合作為化學(xué)預(yù)處理劑［14-15］，DTT較巰基乙醇更有利于青霉屬菌株原生質(zhì)體的釋放［8］。綜合比較菌體預(yù)處理物理法和化學(xué)法時(shí)，選用超聲法和二硫蘇糖醇(DTT)浸漬法作為代表，研究不同前處理方法對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。如表1所示，冰浴放置24 h的前處理方式并沒有讓原生質(zhì)體產(chǎn)量出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)效率，故不建議使用。

進(jìn)一步比較DTT浸漬法和超聲法在時(shí)間上對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的連續(xù)影響。如圖5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1～4 h的酶解時(shí)間范圍內(nèi)，2種預(yù)處理組的原生質(zhì)體產(chǎn)量都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)超聲預(yù)處理法的原生質(zhì)體產(chǎn)量都較DTT浸漬法高，但DTT處理組的原生質(zhì)體產(chǎn)生速率均高于超聲處理組，并在3～4 h的時(shí)間區(qū)間菌體原生質(zhì)體的釋放量急劇增加，這可能與硫醇化合物DTT可使細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)成分的二硫鍵還原導(dǎo)致細(xì)胞壁更疏松有關(guān)［16］，加之酶解作用時(shí)間的不適可能造成了菌體損傷而導(dǎo)致4 h時(shí)的原生質(zhì)體大量釋放。微生物菌株的不同所導(dǎo)致的菌體膜結(jié)構(gòu)差異，可能是物理法更適合本實(shí)驗(yàn)菌體制備原生質(zhì)體的原因。

表1 不同預(yù)處理方法對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Table1 Comparison of different pre-treatment methods on protoplasts production

圖5 超聲前處理與DTT浸漬對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量影響的對(duì)比Fig.5 Comparison of protoplast production with ultrasonication and DTT pre-treatment

2.2 原生質(zhì)體形態(tài)和形成釋放方式的顯微觀察

2.2.1 原生質(zhì)體形態(tài)顯微觀察 原生質(zhì)體的形態(tài)觀察結(jié)果:菌體在溶壁酶(10 mg/mL)的作用下，34℃溫浴1～2 h開始緩慢釋放原生質(zhì)體，在3～4 h時(shí)原生質(zhì)體釋放量不斷增加。在原生質(zhì)體釋放初期，菌絲頂端膨大，其間伴隨著菌絲的斷裂。菌絲頂端首先釋放原生質(zhì)體(頂端釋放)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲頂端釋放逐漸完成，大多數(shù)菌絲酶解成為菌絲片段進(jìn)一步開始釋放原生質(zhì)體(側(cè)位釋放、原位釋放和頂端釋放)，原生質(zhì)體進(jìn)入釋放中期，此時(shí)顯微鏡視野下出現(xiàn)大量未酶解的菌絲體片段，原生質(zhì)體出現(xiàn)大量釋放。在原生質(zhì)體釋放末期(5 h時(shí))，菌絲幾乎全部瓦解，原有釋放的原生質(zhì)體因酶解作用導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破損，原生質(zhì)體質(zhì)量下降。在原生質(zhì)體釋放過(guò)程中，起初釋放的較小的原生質(zhì)體在溫浴的過(guò)程中會(huì)逐漸增大，在顯微鏡下出現(xiàn)了大小不一的原生質(zhì)體，該現(xiàn)象存在于真菌原生質(zhì)體的相關(guān)研究中［8，17］。

2.2.2 原生質(zhì)體形成和釋放方式顯微觀察 目前絲狀真菌原生質(zhì)體的形成和釋放方式有4種形式［18］:①頂端釋放;②段端位釋放;③側(cè)位釋放;④原位釋放。絲狀真菌因種屬分類不同所呈現(xiàn)的原生質(zhì)體形成和釋放方式不同，一般僅含有少于4種的釋放方式。如圖6所示，本實(shí)驗(yàn)所采用的供試菌株皮殼青霉存在以上4種原生質(zhì)體形成和釋放方式，原生質(zhì)體形成方式全面，且顯微觀察發(fā)現(xiàn)該菌株還出現(xiàn)了類似酵母“出芽”的釋放方式(如圖7)，據(jù)報(bào)道該釋放形式是酵母原生質(zhì)體特有的釋放方式［19］，但是出現(xiàn)在酶解過(guò)程中的原生質(zhì)體“出芽”形成釋放方式還是首次報(bào)道。

圖6 顯微觀察的菌體原生質(zhì)體組圖及其釋放方式(400×)Fig.6 Images of protoplast formation and releasing way with microscopy(400×)

圖7 顯微觀察的菌體原生質(zhì)體類似酵母“出芽”的釋放方式(400×)Fig.7 Images of protoplast formation in a new releasing way with microscopy(400×)

3 討論

由于絲狀真菌的細(xì)胞壁組成較為復(fù)雜且不同真菌的細(xì)胞壁組成也存在差異，因此原生質(zhì)體的制備和形成釋放方式也有所區(qū)別。本研究采用超聲法預(yù)處理，在合適的酶解條件下，皮殼青霉的原生質(zhì)體形成量達(dá)到4.71×106個(gè)/mL。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)該菌株原生質(zhì)體的形成釋放方式包括頂端釋放、側(cè)位釋放、菌絲段端位釋放和原位釋放以外的另一種全新的類似酵母“出芽”的釋放形式。

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