黃端華，張銀平，劉 薇，張 蘭

(1.福建船政交通職業(yè)學(xué)院安全技術(shù)與環(huán)境工程系，福建福州 350007;2.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院食品安全分析與檢測技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002)

0 引言

胡蘆巴是豆科一年生草本植物，藥用部位是成熟后的胡蘆巴干種子，有祛風(fēng)、溫腎、祛寒、抗糖尿病、降低膽固醇等功效，該藥材能治療腹脅脹滿、支氣管炎、寒疝、腎臟冷虛.中藥胡蘆巴中富含生物堿、黃酮和皂苷等成分，其中胡蘆巴堿(TR)、槲皮素(QU)和柚皮素(NA)等為主要有效成分［1］.圖1為TR、QU和NA的分子結(jié)構(gòu)圖.葫蘆巴堿具有止咳、退熱、降血糖、降膽固醇等作用［2］;柚皮素能治療細(xì)菌感染，具有鎮(zhèn)靜、利膽等作用;槲皮素是較常見的黃酮類物質(zhì)，具有平喘、降血壓和止咳等作用.我國胡蘆巴主要分布在四川、河南、安徽等地區(qū)，因產(chǎn)地或采摘季節(jié)不同，各產(chǎn)區(qū)胡蘆巴中主要成分的含量存在較大差異.人們對醫(yī)藥使用要求逐漸提高，中藥成分的含量、藥理及結(jié)構(gòu)分析日益受到重視，因此準(zhǔn)確快速測定胡蘆巴藥材中的有效成分含量對葫蘆巴質(zhì)量控制及確保臨床療效有重要的指導(dǎo)意義.

目前，已有報道采用高效液相色譜法單獨(dú)測定胡蘆巴種子中TR的含量［3－4］及研究TR在大鼠體內(nèi)的代謝分析［5］.HPLC作為一種常規(guī)的分析方法操作較繁瑣且易造成環(huán)境污染，而近年來，毛細(xì)管電泳法因其高效、快速、操作簡便和分離模式多等優(yōu)點(diǎn)，已有大量的文獻(xiàn)報道采用CE法測定天然藥物中的有效成分，Wang Hai－yan等［6］采用毛細(xì)管電泳場放大樣品堆積測定苦參中的生物堿，Yin Xiao－fang等［7］采用MSS－CE法分析中成藥中的的士寧和馬錢子堿，Gan Zhi－bin等［8］采用CE法分析槐米和秦皮中的生物活性成分.對葫蘆巴干種子中多種有效成分的提取并進(jìn)行質(zhì)量分析還未有文獻(xiàn)報道.本研究采用毛細(xì)管電泳法同時分離和檢測TR、QU和NA三種組分，在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)采用普通區(qū)帶電泳法同時分離和檢測這3種物質(zhì)時只出現(xiàn)兩個峰，其中一個被有機(jī)溶劑的倒峰重疊，難以被檢出.本研究通過反復(fù)試驗(yàn)，選擇了合適的添加劑和最優(yōu)的電泳介質(zhì)，成功解決了該問題，并實(shí)現(xiàn)葫蘆巴中TR、QU和NA在高效毛細(xì)管電泳儀中的同時分離和檢測.

圖1 TR，QU和NA的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of TR，QU and NA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效毛細(xì)管電泳儀(俄羅斯LUMEX公司，105型)，包括可變波長紫外檢測器(190～400 nm);M1cw15工作站(俄羅斯LUMEX公司);未涂層熔融石英毛細(xì)管，70 cm×75 μm(id)，有效長度60 cm，購自河北永年縣銳豐色譜器件有限公司;紫外－可見分光光度計，雙光束(760CRT).

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胡蘆巴種子藥材購自福州藥店，TR、NA和QU的標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所).硼酸、硼砂、磷酸二氫鉀(KDP)、DMF、甲醇和曲拉通X－100均為AR級，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，水為二次蒸餾水.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)胡蘆巴藥材成分的提取及制備.準(zhǔn)確稱取2.990 g的胡蘆巴種子，加入5 mL水和0.07 569 g NaCl浸泡24 h.采用超聲波儀處理30 min后，過濾獲得透明液體，并準(zhǔn)確定容至5 mL.取300 μL樣品，添加100 μL 甲醇和 600 μL 水，用0.22 μm 的濾膜過濾.

2)對照品溶液的配制.精確稱取0.300 mg TR、QU和NA，加入體積比為2∶1的甲醇和水溶液，利用超聲處理使組分充分溶解，分別配制成濃度為1 000 μg·mL－1的溶液.

3)運(yùn)行液的配制.分別精確稱取3.814和1.362 g的硼砂和磷酸二氫鉀(KDP)，定容于100 mL的容量瓶，配制成濃度為0.1 mol·L－1硼砂(Na2B4O7·10H2O)和 0.1 mol·L－1的磷酸二氫鉀(KDP)母液.將稀釋成10 mmol·L－1的KH2PO4(KDP)溶液分別與10 mmol·L－1Na2B4O7的溶液根據(jù)配制表的比例進(jìn)行混合，配得pH為5.80～9.20的一系列KDP－Na2B4O7緩沖液.分析所用樣品及運(yùn)行緩沖液在使用前均經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾，并作超聲脫氣處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

根據(jù)TR、QU和NA 3組分的分子結(jié)構(gòu)，經(jīng)紫外分光光度計在190～400 nm范圍內(nèi)掃描，得知TR、QU和NA在200～240 nm范圍內(nèi)均有較好的紫外吸收，如圖2所示.再經(jīng)毛細(xì)管電泳分析試驗(yàn)3種混合成分在204～244 nm之間5個波長下的出峰情況，選定檢測波長為224 nm.

圖2 TR、QU、NA的吸收譜圖Fig.2 The wavelength spectrogram of TR，QU and NA

2.2 電泳介質(zhì)的選擇

分別以20 mmol·L－1pH 7.0磷酸鹽體系、20 mmol·L－1pH 9.0 硼酸鹽體系、10 mmol·L－1pH 3.0 檸檬酸體系及30 mmol·L－1pH 9.0 KDP － 硼砂緩沖體系為運(yùn)行緩沖液，考察了不同的緩沖體系對出峰情況和分離效果的影響.結(jié)果表明，在硼酸－硼砂、檸檬酸鹽和磷酸氫二鉀－磷酸二氫鉀緩沖介質(zhì)中柚皮素與槲皮素?zé)o法出峰或難以分離;只有在KDP－硼砂緩沖液中能觀察到其中的兩個組分，且兩組分電泳峰尖銳、峰形對稱，因此選擇KDP－硼砂溶液作為電泳介質(zhì).

2.3 運(yùn)行液KDP－硼砂濃度的選擇

試驗(yàn)了緩沖液濃度為3～15 mmol·L－1的6個點(diǎn)，反映緩沖溶液濃度對分析物分離效果的影響，結(jié)果見圖3.由圖3可知，隨著濃度的增加，遷移時間也延長，但分離度得到了提高，濃度為10 mmol·L－1的緩沖溶液能夠使樣品在較短的時間內(nèi)得到較好的分離，因此選擇濃度為10 mmol·L－1.

2.4 KDP－硼砂運(yùn)行液酸度的優(yōu)化

考察了pH值在7.2～9.0時，添加體積分?jǐn)?shù)為0.25%DMF、0.25%曲拉通的10 mmol·L－1KDP－硼砂緩沖液對TR、NA、QU分離效果的影響.緩沖溶液的pH值在電泳分離中起著重要作用，它將影響電滲流，影響分析物的遷移時間.圖4表明，隨著pH值的增大，3種組分呈現(xiàn)良好的分離趨勢.pH為7.8時，3種組分遷移時間較短又能得到完全分離，選定pH為7.8.

圖3 KDP－硼砂體系濃度與分析時間曲線圖Fig.3 Effect of concentration on migration time

圖4 pH對分析時間的影響Fig.4 Effect of pH on migration time

2.5 電泳介質(zhì)中添加劑的選擇及優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)顯示，選擇合適的分離緩沖溶液體系可使3種組分達(dá)到一定的分離度，但溶劑的倒峰與葫蘆巴堿重合使其無法檢出.有文獻(xiàn)報道在緩沖液體系中適當(dāng)引入一定量的有機(jī)溶劑或表面活性劑等添加劑可有效地改善樣品的遷移時間和分離效果［9］，進(jìn)而提高分離選擇性.實(shí)驗(yàn)考察了有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙腈、DMF和表面活性劑SDS、triton X－100、吐溫80、CTMB對分離效果的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同時添加曲拉通和DMF對溶劑與TR的分離有明顯效果，能改善TR和溶劑的分離.通過實(shí)驗(yàn)考察triton X－100與DMF體積濃度的大小對甲醇和葫蘆巴堿分離的影響.

2.5.1 Triton X －100 濃度的選擇

在KDP－硼砂運(yùn)行液中，3種組分能得到較好的分離，但TR在沒有添加Triton X－100和DMF的情況下因受溶劑影響，TR峰與溶劑倒峰相重合.在實(shí)驗(yàn)過程中得知，曲拉通的加入減小了溶劑的影響.在電泳介質(zhì)中添加表面活性劑曲拉通，能夠降低電滲流，使各組分的遷移時間產(chǎn)生差異.配制含曲通濃度為0.05%、0.10%、0.15%和0.25%的電泳緩沖液，得到TR與溶劑的分離電泳譜圖，見圖5.圖5表明，曲拉通加入量的增加使得TR受到的影響逐漸減小，TR的峰從未能檢出到峰高逐漸增大，甲醇的倒峰與TR的分離也逐漸明顯;圖5(d)中，TR的檢出不受溶劑影響，增加濃度后TR的峰高與圖5(d)大致相同，為縮短分析時間，選擇曲拉通體積分?jǐn)?shù)為圖5(d)所對應(yīng)的0.25%.文中添加的曲拉通濃度未達(dá)到臨界膠束濃度(cmc為0.18 mmol·L－1)，僅作為添加劑使用，Trition X－100是一種非電解質(zhì)高分子添加劑，它能增加緩沖液黏度，可能形成分子團(tuán)或特殊的局部結(jié)構(gòu)，抑制或消除電滲，從而影響樣品的遷移過程，改善分離［10］.

圖5 不同體積濃度triton X－100的影響Fig.5 The effect of triton concentration on resolution

2.5.2 DMF 濃度的影響

經(jīng)過試驗(yàn)，在電泳介質(zhì)中僅加入DMF或僅加入曲拉通，或者其他的添加劑，均無法實(shí)現(xiàn)TR與溶劑的分離，只有當(dāng)DMF與曲拉通進(jìn)行混合使用，兩種添加劑的共同作用才使溶劑的干擾減小.在電泳介質(zhì)中DMF與曲拉通的共同作用表現(xiàn)出高的粘度，TR是帶電的兩性物質(zhì)，溶劑為中性，兩者的遷移速率在添加劑作用下產(chǎn)生了差異.圖6是DMF濃度對分離的影響.結(jié)果顯示，圖6(c)體積分?jǐn)?shù)為0.25%的TR的檢出不受溶劑干擾，分離效果最好，遷移時間最短.

2.6 最佳分離條件

圖6 DMF濃度的選擇Fig.6 Effect of DMF concentration on resolution

選擇最佳分離條件為:緩沖溶液為濃度為10 mmol·L－1、pH 為7.8 的 KDP － 硼砂體系，添加表面活性劑0.25%triton X－100及有機(jī)溶劑0.25%DMF，運(yùn)行電壓為20 kV，進(jìn)樣壓力3.0 kPa，進(jìn)樣時間10 s，紫外吸收波長224 nm.圖7是在最優(yōu)分離條件下對對照品混合液進(jìn)行電泳分離的CE譜圖.

2.7 工作曲線和檢出限

分別配制TR、QU和NA對照品混合樣，濃度在1.0×10－6～2 ×10－4g·mL－1.在最佳的電泳條件下對標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)行電泳分析，考察峰面積(Y)與對照品質(zhì)量濃度(X)的線性關(guān)系.計算得到3種有效成分的回歸方程、r2、檢出限和線性范圍，列于表1.由表1可以看出，各分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均大于0.999;以信噪比為3確定3種組分的檢出限為 0.2 ～1.0 μg·mL－1.

文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜測定胡蘆巴中葫蘆巴堿［4］和槲皮素［11］的線性范圍分別是3.75 ～37.5 μg·mL－1和 0.184 ～3.68 μg·mL－1，而本實(shí)驗(yàn)測定葫蘆巴堿的線性范圍是 3.0 ～200.0 μg·mL－1，檢測限 0.7 μg·mL－1，測定槲皮素的線性范圍 5.0 ～150.0 μg·mL－1.通過比較表明，所建立的方法線性范圍寬，檢測限低.

圖7 3種成分對照品的CE譜圖Fig.7 The electrophorograms of mixed standards

表1 線性關(guān)系和檢測限Tab.1 The regression equations and the detection limits

配制濃度為120 mmol·L－1的TR，50 mmol·L－1的QU 和90 mmol·L－1的NA 混合標(biāo)準(zhǔn)樣，在最優(yōu)條件下進(jìn)行測定，重復(fù)分析5次，計算得到峰面積及遷移時間的RSD，列于表2.由表2可以看出，遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=5)在1.5%以內(nèi);峰面積的RSDs(n=6)在5%以內(nèi).

2.8 樣品測定及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)條件下，采用工作曲線法定量分析提取后的胡蘆巴樣品，測得其中葫蘆巴堿、槲皮素和柚皮素的含量結(jié)果為28.6、2.7、45.6 μg·g－1，詳見表3.胡蘆巴實(shí)際樣品的電泳譜圖見圖8.從圖8中可知，樣品中的有效成分在最佳條件下均實(shí)現(xiàn)了分離.

表2 峰面積及遷移時間的精密度Tab.2 The repeatability of peak area and migration time(n=5)

表3 胡蘆巴干種子樣品中組分的含量Tab.3 Content of analytes in fenugreek samples(n=5)

分別向胡蘆巴樣品提取液中準(zhǔn)確地添加兩種質(zhì)量濃度的葫蘆巴堿、柚皮素及槲皮素的對照品混合液，使得所添加濃度為20.00和40.00 μg·mL－1，每個添加水平重復(fù)測定5次，計算出回收率和精密度，列于表4.從表4可以看出，TR、NA和QU的平均回收率分別為95.5% ～111.2%，RSD為2.2% ～3.8%.回收率與精密度基本滿足胡蘆巴中3種有效成分的檢測要求.

圖8 葫蘆巴種子樣品CE譜圖Fig.8 The electrophorograms of real sample

表4 添加不同質(zhì)量濃度組分的回收率Tab.4 Recoveries for the analytes at different spiked levels(n=5)

［1］周淑晶.中藥葫蘆巴的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中藥研究與信息，2000，2(5):19－22.

［2］史江華，李多偉，逄敏杰，等.葫蘆巴研究新進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2007，22(3):153－155.

［3］劉廣學(xué)，尚明英，李輝，等.胡蘆巴藥材中胡蘆巴堿的提取方法及其含量測定［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6(4):11－14.

［4］吳延麗，李微，林鋒，等.大慶產(chǎn)胡蘆巴種子中生物堿及總黃酮成分的研究［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，41(4):385－387.

［5］陳勇，沈少林，陳懷俠，等.HPLC－MSn法鑒定葫蘆巴堿及其在大鼠體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物［J］.藥學(xué)學(xué)報，2006，41(3):216－220.

［6］Wang Hai－yan，Lu Yu － chao，Chen Jie，et al.Subcritical water extraction of alkaloids in Sophora flavescens ait and determination by capillary electrophoresis with field － amplified sample stacking［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，58:146 －151.

［7］Yin Xiao－fang，Li Zhi，Zhang Shuai－h(huán)ua，et al.Determination of strychnine and brucine in traditional Chinese medicine preparations by capillary zone electrophoresis with micelle to solvent stacking［J］.Chinese Chemical Letters，2011，22:330 －333.

［8］Gan Zhi－bin，Chen Qi－wen，F(xiàn)u Yue－jiao，et al.Determination of bioactive constituents in flos sophorae immaturus and cortex fraxini by capillary electrophoresis in combination with far infrared － assisted solvent extraction［J］.Food Chemistry，2012，130:1 122－1 126.

［9］Dimitrova Pepa，Bart Hans－Jorg.Non－ionic surfactant modified ligand exchange chromatography using copper(II)complex of N，N －dimethyl－l－phenylalanine as the chiral additive for enantioselective amino acids separation［J］.Analytica Chimica Acta，2010，663:109－116.

［10］陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用［M］.2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:49.

［11］魯鑫焱，張超，趙懷清，等.不同產(chǎn)地胡蘆巴中總黃酮和槲皮素的含量測定［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2004，21(6):430－433.