劉懷阿， 蘇建坤， 劉 琴， 李 婷， 楊鐘靈， 蔣 歡，3

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225007;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095;3.重慶市涪陵區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，重慶 涪陵 408000)

馬蹄蓮(Zantedeschia spp.)是天南星科馬蹄蓮屬多年生草本球根花卉植物，原產(chǎn)于南部非洲，被分為兩類［1-2］。一類為 Zantedeschia，如白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)，該類植物地下莖為肉質(zhì)根狀，具有較強(qiáng)抗寒性，對(duì)軟腐病具有一定的耐性。另一類為Aestivae，常被稱為彩色馬蹄蓮，該類植物花色多樣，地下莖肉質(zhì)塊狀耐寒性較弱，需要休眠，易發(fā)細(xì)菌性軟腐?。?］。

引起馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病的病原菌主要為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacterterium carotovorum subsp.carotovorum，1988年前為 Erwinia carotovora subsp.carotovora，下文簡(jiǎn)稱 Pcc)［4-9］。Pcc寄主范圍廣泛，包括馬蹄蓮、結(jié)球甘藍(lán)、胡蘿卜、黃瓜、辣椒、蕪青、萵苣和馬鈴薯等［10］。這種土傳兼性厭氧性細(xì)菌在馬蹄蓮生長(zhǎng)期和種球貯藏期侵染。發(fā)病初期葉片退綠黃化，呈水浸狀壞死，隨后發(fā)病加重，出現(xiàn)軟腐，發(fā)出惡臭，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)植株在幾天之內(nèi)死亡［3，11］。Pcc引起的軟腐病一直是植物病理學(xué)研究的熱點(diǎn)課題，特別是在其全基因序列公布后［12］，與其致病相關(guān)的研究更有所增加［13-14］。

植物病原菌的致病過(guò)程是病原菌與寄主相互作用的過(guò)程，該過(guò)程由一系列致病因子參與。為了研究根瘤菌與甘草之間的共生固氮機(jī)制，Cai等人［15］運(yùn)用甘草種子浸提物誘導(dǎo)中慢生型天山根瘤菌結(jié)瘤基因的表達(dá)，從5 000多個(gè)轉(zhuǎn)座子插入突變株中獲得8株受寄主誘導(dǎo)的突變株，鑒定出了中慢生型天山根瘤菌和其宿主甘草在共生固氮結(jié)瘤早期的信號(hào)交流中發(fā)揮作用的基因，并且提出了根瘤菌的LysE系統(tǒng)和其宿主植物分泌物中刀豆氛酸的互作模型。

為探尋Pcc的致病相關(guān)基因在致病過(guò)程中與寄主之間的關(guān)系，本研究擬利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入法構(gòu)建Pcc突變體文庫(kù)，通過(guò)寄主白花馬蹄蓮的組織提取液誘導(dǎo)Pcc中某些基因的表達(dá)，篩選獲得受寄主誘導(dǎo)，且與致病性相關(guān)的突變株，進(jìn)而對(duì)這些基因的功能進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步研究Pcc的致病機(jī)制以及制定病害防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、引物、培養(yǎng)基與植物材料

胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種 Pcc菌株P(guān)ccS1，由本實(shí)驗(yàn)室分離和鑒定［6］。其他菌株與質(zhì)粒見表1，所需引物見表2。胡蘿卜軟腐果膠桿菌及其相關(guān)突變株均用2YT培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)。E.coli菌株用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，試驗(yàn)所需限制性內(nèi)切酶、連接酶和rTaq酶均購(gòu)自TaKaRa公司。

表1 供試菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 試驗(yàn)所用引物Table 2 The primers used in this study

白花馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、黃花馬蹄蓮(Z.elliotiana)均為本研究室引進(jìn)品種，溫室栽培;大白菜(Brassica pekinensis)為南京市場(chǎng)銷售產(chǎn)品早熟五號(hào)。

白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)組織提取液(ZaE)，參照Aretusa等［18］介紹方法制備。挑選長(zhǎng)勢(shì)、大小一致的白花馬蹄蓮葉片10 g，75%酒精表面消毒，加入50 ml去離子水研磨，紗布過(guò)濾2次，取濾液，6 000 r/min、4℃離心10 min，離心 4～5次，取上清，用0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得20%的葉片提取液，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PccS1突變體文庫(kù)的構(gòu)建以及目的菌株的篩選

將PccS1在含利福平(Rif)100 μg/ml的2YT固體培養(yǎng)基上劃線，28℃下約17 h后，挑去單菌落在28℃、2YT液體培養(yǎng)基中，220 r/min振蕩，過(guò)夜培養(yǎng)后，按1∶100轉(zhuǎn)接到2YT(100 μg/ml Rif)液體培養(yǎng)基，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600為0.6 ～0.8，分裝至2 ml滅菌離心管，8 000 r/min離心，棄上清，用不含抗生素的2YT液體培養(yǎng)基漂洗3次，去除殘留抗生素，用100 μl液體2YT培養(yǎng)基懸浮，獲得受體菌;以E .coli SM10λpir(pJZ260，含有mariner轉(zhuǎn)座子，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院朱軍教授提供)為供體菌，制備方法與供體菌相同，但液體培養(yǎng)基中添加抗生素為氨芐青霉素(Amp)100 μg/ml和氯霉素(Cm)100 μg/ml。將滅菌濾膜(孔徑 0.22 μm，直徑25 mm)置于2YT平板，在每張濾膜上分別滴加25 μl受體菌和供體菌，充分混合，37℃培養(yǎng)1 h后，轉(zhuǎn)入28℃培養(yǎng)12～14 h。50 μl受體菌和供體菌分別滴加濾膜，作為對(duì)照。1 ml液體2YT培養(yǎng)基洗滌濾膜，洗滌液8 000 r/min離心3 min，適量2YT培養(yǎng)基懸浮菌體，分別涂布于2YT平板［含100 μg/m Rif+100 μg/ml Cm+40 μg/ml卡拉霉素(Km)+3%ZaE］，28℃下倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落，分別一一對(duì)應(yīng)接種在100 μg/ml Rif+100 μg/ml Cm+40 μg/ml Km+3%ZaE(下文簡(jiǎn)稱2YT-A)平板和100 μg/ml Rif+100 μg/ml Cm+40 μg/ml Km(下文簡(jiǎn)稱2YT-B)平板上，只在2YT-A平板上能生長(zhǎng)的菌株，可以初步確定該菌株為受白花馬蹄蓮組織液誘導(dǎo)、Km基因得到表達(dá)的突變株。

1.3 受馬蹄蓮組織提取液誘導(dǎo)的突變株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

接種突變株(接種量1%)至兩瓶50 ml MMX液體培養(yǎng)基(40 μg/ml Km)中，一瓶加入 3%ZaE，而另一瓶加入相同體積的無(wú)菌水做對(duì)照，28℃、200 r/min培養(yǎng)。每隔4 h測(cè)定菌體濃度(OD600)。

1.4 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定及序列分析

突變株、pUC19分別用SalⅠ酶切后，連接獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB(100 μg/ml Cm)固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行驗(yàn)證后，用轉(zhuǎn)座子兩端引物(Km-1和137-1)進(jìn)行測(cè)序并拼接。測(cè)序結(jié)果用 NCBI上的BLASTx進(jìn)行序列比對(duì)。

1.5 ubiG缺失突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

1.5.1 ubiG缺失突變體的構(gòu)建及驗(yàn)證 設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR從ubiG、ubiG上下游以及Km片段的5'端和3'端擴(kuò)增得到 U1(367 bp)、U2(438 bp)和Km(1 514 bp)DNA片段。純化后分別用EcoRⅠ/HindⅢ、HindⅢ/KpnⅠ和KpnⅠ/XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，回收，連接自殺載體pEX18GM構(gòu)建重組載體，導(dǎo)入E.coli BW20676中獲得供體菌。供體菌與受體菌PccS1兩親結(jié)合，得到一次交換子，一次交換子220 r/min振蕩4 h，菌液涂布于含有10%蔗糖的2YT固體平板上篩選得到突變體。以UF1和UR2為上下游引物擴(kuò)增突變株中2 319 bp的片段和野生型中1 525 bp的片段。

1.5.2 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證 利用廣宿主載體pBBR1-MCS5構(gòu)建ubiG基因的互補(bǔ)載體。設(shè)計(jì)引物HUF和HUR從PccS1中擴(kuò)增ubiG基因片段和其啟動(dòng)子片段(1 315 bp)。HindⅢ和XbaⅠ雙酶切回收后與載體pBBR1-MCS5連接得到重組載體，導(dǎo)入E.coli BW20676中獲得供體菌，與受體菌△ubiG兩親結(jié)合，獲得互補(bǔ)菌株△ubiG(ubiG)。用載體上的引物GmF和GmR擴(kuò)增互補(bǔ)菌株約500 bp的片段，以及引物HUF和HUR擴(kuò)增目的片段，驗(yàn)證互補(bǔ)菌株。

1.6 缺失突變株和互補(bǔ)菌株的表型及活性分析

1.6.1 致病性測(cè)定 將 PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別在含有相應(yīng)抗生素的液體2YT培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無(wú)菌水懸浮并調(diào)整OD600至0.6，取5μl接種于黃花馬蹄蓮(Z.elliotiana)和白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)葉片和大白菜葉柄上(接種前用75%酒精表面消毒)。試驗(yàn)重復(fù)3次，置于25℃保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

1.6.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別在含有相應(yīng)抗生素的液體2YT培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無(wú)菌水懸浮并調(diào)整OD600至0.6，然后按1∶100的比例接種于2TY培養(yǎng)基中，每小時(shí)測(cè)定1次菌液OD600值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 沉降性測(cè)定 將 PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0，取出后豎直靜置24 h，觀察各菌株的菌體狀態(tài)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.4 生物膜測(cè)定 主要參照Toole等［19］的方法，將PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無(wú)菌水懸浮并調(diào)整 OD600為1.0，按1∶100比例轉(zhuǎn)接到小試管中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0，吸盡菌液，用等體積的無(wú)菌水清洗2次，加入等體積的1%結(jié)晶紫染色20 min，吸盡結(jié)晶紫，無(wú)菌水清洗3次，觀察試管壁上是否有一圈紫色物質(zhì)。用1 ml 90%乙醇溶解，575 nm測(cè)量吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.5 抗生素耐受性測(cè)定 所用抗生素包括四環(huán)素、氯霉素、頭孢霉素、羧芐青霉素、壯觀霉素、硫酸鏈霉素、硫酸新霉素以及氨芐青霉素，均配制為100 mg/ml，制 備 抗 生 素 終 濃 度 分 別 為 5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、90 μg/ml和 100 μg/ml的 2YT 平板培養(yǎng)基。若菌株抗性大于100 μg/ml，則再根據(jù)具體抗性濃度而設(shè)置抗生素終濃度。

將PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無(wú)菌水懸浮并調(diào)整OD600為1.0，各取2.5 μl接種于各濃度的抗生素平板上，28℃中培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.6.6 胞外酶活性檢測(cè) 蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中加入1%高溫滅菌的脫脂牛奶。參照Yi等［20］制備果膠酶酶和纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基。

將待測(cè)菌株分別在含有相應(yīng)抗生素的液體2YT培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無(wú)菌水懸浮并調(diào)至OD600為2.0，取2.5 μl分別接種于各檢測(cè)平板上，28℃培養(yǎng)48 h。通過(guò)觀察不同胞外酶檢測(cè)平板上降解圈的大小來(lái)判斷菌株胞外酶活性。在蛋白酶檢測(cè)平板上可直接觀察菌落周圍透明降解圈的大小。果膠酶平板的觀察:加入7.5%醋酸銅染色1 h。纖維素酶平板的觀察:先加入0.2%剛果紅染色20 min，再加入1 mol/L NaCl漂洗15 min，最后用1 mol/L HCl著色5 min，根據(jù)降解圈的大小比較突變菌株產(chǎn)生胞外酶的差異。

1.6.7 菌體形態(tài)和鞭毛觀察 PccS1和突變株△ubiG分別用含相應(yīng)抗生素的2YT平板純化，28℃培養(yǎng)20 h，單菌落制成菌懸液，PTA負(fù)染，日立H-7650透射電鏡觀察菌體形態(tài)及鞭毛。

2 結(jié)果

2.1 彩色馬蹄蓮組織提取液誘導(dǎo)突變株(Km表達(dá))的篩選

本研究中mariner轉(zhuǎn)座子上含有沒有啟動(dòng)子的卡那霉素抗性基因(Km)，當(dāng)它轉(zhuǎn)座插入到某個(gè)啟動(dòng)子后面或基因的內(nèi)部，Km的表達(dá)就會(huì)受到該啟動(dòng)子的調(diào)控。挑取在2YT-A平板上生長(zhǎng)的單菌落分別點(diǎn)在2YT-A平板和2YT-B平板上。能生長(zhǎng)的就是Km基因得到表達(dá)的突變株，即卡那霉素抗性基因插在組成型表達(dá)的基因內(nèi)或者是被ZaE誘導(dǎo)表達(dá)的基因內(nèi)。

通過(guò)此方法篩選獲得1株能夠誘導(dǎo)Km抗性基因表達(dá)的突變株，對(duì)突變株進(jìn)行生長(zhǎng)速率測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變株在添加Km的培養(yǎng)基和添加ZaE+Km的培養(yǎng)基中的菌體濃度(OD600)在生長(zhǎng)20 h后發(fā)生明顯差異，突變體在未加ZaE的培養(yǎng)基中的OD600值持續(xù)在1.0左右，而在加入ZaE的培養(yǎng)基中可持續(xù)生長(zhǎng)(圖1)。

圖1 馬蹄蓮組織提取液(ZaE)對(duì)突變株的誘導(dǎo)Fig.1 Induction of mutant by Zantedeschia aethiopica extraction

2.2 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)序列分析

通過(guò)亞克隆技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。將測(cè)序所得序列拼接，找到1個(gè)720 bp的開放閱讀框(ORF)。Blast分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于輔酶Q氧甲基轉(zhuǎn)移合成酶(Ubiquinone biosynthesis O-methyltransferase)編碼基因ubiG。轉(zhuǎn)座子插在了該閱讀框的199 bp與200 bp之間。該基因全長(zhǎng)720 bp，與 P.carotovorum subsp.carotovorum 菌株 PC1 有99%的同源性。

2.3 ubiG基因缺失突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.3.1 突變體△ubiG的構(gòu)建及驗(yàn)證 自殺重組質(zhì)粒pEXubiG經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖2，兩個(gè)片段分別為載體pEX18GM和目的片段。驗(yàn)證重組載體構(gòu)建成功后，通過(guò)兩親交配得到目標(biāo)突變體。利用引物UF1和UR2對(duì)目標(biāo)突變體PCR驗(yàn)證，突變體可擴(kuò)增獲得2 319 bp片段，野生株擴(kuò)增獲得1 525 bp片段(圖3)。

圖2 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Digestion of the recombinant plasmid with EcoR I and Xba I

圖3 缺失突變體用引物UF1和UR2進(jìn)行PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of the deletion mutants with primers UF1 and UR2

2.3.2 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證 將ubiG基因和啟動(dòng)子片段連接到載體pBBR1-MCS5上，得到重組載體。重組載體經(jīng)HindⅢ和Xba I雙酶切驗(yàn)證(圖4)，導(dǎo)入突變株△ubiG，得到互補(bǔ)菌株△ubiG(ubiG)?；パa(bǔ)菌株經(jīng)引物GmF、GmR(約500 bp)和HUF、HUR(1 315 bp)驗(yàn)證正確(圖 5)。

圖4 重組載體經(jīng)HindⅢ和Xba I雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Digestion of the recombinant vector with Hind Ⅲ and Xba I

圖5 △ubiG(ubiG)用引物 GmF、GmR和 HUF、HUR進(jìn)行PCR驗(yàn)證Fig.5 PCR identification of strain △ubiG(ubiG)with primers GmF，GmR and HUF，HUR

2.4 缺失突變株和互補(bǔ)菌株的表型及活性分析

2.4.1 致病性 致病性測(cè)定結(jié)果顯示，突變株在不同寄主上的致病性均減弱，從圖6可以得出黃花馬蹄蓮(Z.elliotiana)和白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)上野生型的病斑面積為突變株的2倍左右，致病性減弱不明顯，而在大白菜上野生型的病斑面積為突變株的5倍左右?；パa(bǔ)菌株使致病性在大白菜上有一定程度的恢復(fù)，病斑面積約為野生型的80%，而在黃化馬蹄蓮和白色馬蹄蓮上致病性恢復(fù)不明顯。

2.4.2 生長(zhǎng)曲線 為了解ubiG基因缺失是否影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，測(cè)定了野生型菌株 PccS1、突變株△ubiG和互補(bǔ)菌株△ubiG(ubiG)在2TY液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率，并繪制了生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)突變株在遲緩期的生長(zhǎng)稍慢于野生型，野生型在4 h左右開始生長(zhǎng)，而突變株在5 h開始生長(zhǎng)。突變株在對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率相對(duì)于野生型較平緩?；パa(bǔ)菌株沒有恢復(fù)野生型的生長(zhǎng)速率，與突變株基本相似(圖7)。

圖7 突變株△ubiG在2YT培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率Fig.7 Growth rate of ubiG mutant strain in 2YT medium

2.4.3 沉降性 為研究ubiG基因的缺失是否影響PccS1的運(yùn)動(dòng)能力，測(cè)定了PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)的沉降性。將濃度基本一致的菌株P(guān)ccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)豎直放置于試管架上，室溫下靜置24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，突變株△ubiG沉降速度明顯快于野生型PccS1和互補(bǔ)菌株△ubiG(ubiG)，△ubiG菌體聚集于試管底部，菌液上層澄清，相比之下，PccS1和△ubiG(ubiG)菌液渾濁，菌體均勻分散于培養(yǎng)基中。

2.4.4 生物膜 為研究ubiG基因缺失是否影響Pcc的生物膜形成能力，分別定性和定量測(cè)定了PccS1、△ubiG以及△ubiG(ubiG)的生物膜產(chǎn)生量。同時(shí)在紫外分光光度計(jì)575 nm下對(duì)生物膜的產(chǎn)生進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果見圖8。可以看出，△ubiG與PccS1相比，生物膜產(chǎn)量減少到野生型的1/2左右，互補(bǔ)菌株生物膜的產(chǎn)量稍低于野生型。

圖8 突變株△ubiG生物膜的定性和定量檢測(cè)Fig.8 Qualitative and quantitative detection of biofilm of ubiG mutant strain

2.4.5 抗生素耐受性 從不同濃度的抗生素平板上觀察發(fā)現(xiàn)，ubiG基因的缺失增強(qiáng)了PccS1對(duì)硫酸鏈霉素(Sm)和硫酸新霉素(Neo)的抗性，Sm對(duì)PccS1的最低抑菌濃度為20 μg/ml，而Sm對(duì)△ubiG的最低抑菌濃度為60 μg/ml，△ubiG對(duì)Sm的抗性是野生型菌株的3倍，互補(bǔ)菌株抗性同突變株。

Neo對(duì)PccS1的最低抑菌濃度同樣為20 μg/ml，但是對(duì)△ubiG的最低抑菌濃度為 550 μg/ml，△ubiG對(duì)Neo的抗性是野生型菌株的27.5倍，互補(bǔ)菌株抗性同突變株。

2.4.6 胞外酶 從3種胞外酶檢測(cè)培養(yǎng)基上觀察發(fā)現(xiàn)，突變株△ubiG在蛋白酶檢測(cè)平板上無(wú)降解水解圈，而在纖維素酶和果膠酶檢測(cè)平板上水解圈大小與野生型差異不明顯?；パa(bǔ)菌株△ubiG(ubiG)對(duì)合成胞外蛋白酶能力沒有恢復(fù)。

2.4.7 菌體形態(tài)以及鞭毛觀察 在透射電鏡下觀察突變株的菌體形態(tài)及鞭毛(圖9)發(fā)現(xiàn)，ubiG基因突變株能夠正常形成4～6根周生鞭毛，與野生型沒有差異，菌體形態(tài)也與野生型無(wú)差異，都呈桿狀。

圖9 野生型PccS1和突變株△ubiG的鞭毛及菌體形態(tài)觀察Fig.9 Flagellum and cell shapes of PccS1 and △ubiG

3 討論

培養(yǎng)基中添加馬蹄蓮組織提取液，插入突變株生長(zhǎng)明顯快于不添加寄主組織提取液的對(duì)照，說(shuō)明寄主提取液中可能存在某種物質(zhì)能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子插入基因的表達(dá)增強(qiáng)，也可能是因?yàn)榧闹鹘M織提取液提供突變株一個(gè)更好的生長(zhǎng)環(huán)境，使得突變株在添加提取液后能夠更好的生長(zhǎng)。所以要探究馬蹄蓮組織是如何誘導(dǎo)ubiG基因表達(dá)，還需要進(jìn)一步研究。

ubiG基因的缺失減弱了PccS1對(duì)不同寄主的致病力，同時(shí)，又影響了菌株的正常生長(zhǎng)，所以致病性的減弱可能是由于缺失突變株生長(zhǎng)不良而引起的。ubiG基因的缺失還加快了菌體的沉降速率，表明菌體運(yùn)動(dòng)能力降低。運(yùn)動(dòng)性是Pcc中的重要致病因子，Mijan Hossain等［23］對(duì) Pcc菌株 PC1 的 fiiC 和motA基因進(jìn)行敲除后，對(duì)大白菜上的致病性減弱，其中fiiC基因缺失后，鞭毛消失，喪失運(yùn)動(dòng)性;而motA基因缺失，菌株雖喪失運(yùn)動(dòng)性，但鞭毛依然存在，說(shuō)明Pcc鞭毛介導(dǎo)的是運(yùn)動(dòng)性而非鞭毛本身影響了病原菌對(duì)寄主的毒力。所以u(píng)biG基因缺失導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力的降低，可能是導(dǎo)致病原菌致病性減弱的原因。

ubiG基因缺失突變株對(duì)不同抗生素的耐受性結(jié)果表明，ubiG基因缺失增強(qiáng)了對(duì)硫酸鏈霉素和硫酸新霉素的抗性，特別是硫酸新霉素，突變株對(duì)其耐受水平是野生型的27.5倍。硫酸鏈霉素和硫酸新霉素都屬于氨基糖苷類抗生素，主要作用于細(xì)菌核糖體的30亞基，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，并破壞細(xì)胞膜的完整性。鏈霉素和新霉素是防治革蘭氏陰性細(xì)菌引起的植物病害的重要抗生素。隨著單一藥劑的長(zhǎng)期大量使用，已經(jīng)引起了病原菌對(duì)鏈霉素的抗藥性［24］，但是還沒有報(bào)道過(guò)對(duì)硫酸新霉素產(chǎn)生抗藥性的植物病原細(xì)菌。細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐受性的原因主要有:(1)減少藥物吸收或藥物在細(xì)菌體內(nèi)的積累;(2)細(xì)菌產(chǎn)生鈍化酶使藥物失活［25］。Yang等［26］在對(duì)Pcc各亞種鏈霉素抗性突變株的研究中，發(fā)現(xiàn)突變株的胞外多糖產(chǎn)量明顯增多，胞外多糖是細(xì)菌生物被膜形成所必需的，而生物膜是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要機(jī)制之一，但是本研究發(fā)現(xiàn)ubiG突變株的生物膜產(chǎn)量比野生型少，故ubiG基因缺失突變株對(duì)兩種抗生素的抗性增強(qiáng)可能是其他原因引起。但本研究基因敲除插入了Km抗性基因，能夠引起突變株對(duì)鏈霉素和硫酸新霉素產(chǎn)生抗性，但是突變株對(duì)鏈霉素和硫酸新霉素的抗性存在較大差異，因此，ubiG基因缺失是否對(duì)鏈霉素和硫酸新霉素抗性產(chǎn)生有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

病原細(xì)菌的蛋白酶可能與提供病原菌蛋白質(zhì)合成所需氨基酸或者降解植物抗性相關(guān)蛋白質(zhì)有關(guān)，Pcc中則至少存在一種蛋白酶(PrtW)，prtW基因缺失嚴(yán)重影響病原菌的毒力［27］。本研究發(fā)現(xiàn)ubiG基因缺失導(dǎo)致突變菌株蛋白酶活力喪失，所以，可以推測(cè)ubiG基因缺失可能間接影響蛋白酶編碼基因的表達(dá)，進(jìn)而影響Pcc的致病性。

突變株的互補(bǔ)菌株對(duì)大白菜的致病性菌體的沉降速率生物膜的產(chǎn)量能夠部分恢復(fù)，而其他表型恢復(fù)不明顯，可能與載體和病原菌基因組的遺傳表達(dá)系統(tǒng)之間存在差異相關(guān)。

綜上所述，利用寄主組織提取液并結(jié)合轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入法研究Pcc與寄主的互作是可行的。ubiG基因與Pcc致病相關(guān)的研究未見報(bào)道，本研究證實(shí)該基因與Pcc的毒力相關(guān)，它可能不直接參與致病，但在致病過(guò)程中起調(diào)控作用，通過(guò)影響菌株的運(yùn)動(dòng)能力以及胞外蛋白酶的活性間接影響致病性。

［1］仇 碩，張翠萍，李秀娟，等.幾種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)彩色馬蹄蓮抗細(xì)菌性軟腐病初探［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(6):106-109.

［2］黃作喜，林忠全，齊澤民.彩色馬蹄蓮種球越冬與貯藏技術(shù)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，201l，39(6):296-297.

［3］SNIJDER R C，VAN TUYL J M.Evaluation of tests to determine resistance of Zantedeschia spp.(Araceae)to soft rot caused by Erwinia carotovora subsp.carotovora［J］.European Journal of Plant Pathology，2002，108:565-571.

［4］SNIJDER R C，LINDHOUT P.Genetic control of resistance to soft rot caused by Erwinia carotovora subsp.carotovora in Zantedeschia spp.(Araceae)，section Aestivae［J］.Euphytica，2004，136:319-325.

［5］易建平，戚龍君，許志剛，等.馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病的鑒定［J］.植物檢疫，2002，16(1):8-10.

［6］谷春艷，范加勤，楊 雪，等.彩色馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病菌的鑒定及其群體感應(yīng)淬滅的研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(3):71-77.

［7］HAUBEN L，MOORE ERB，VAUTERIN L，et al.Phylogenetic position of phytopathogens within the Enterobacteriaceae［J］.System Application Microbiology，1998，21:384-397.

［8］WRIGHT P J，BURGE G K.Irrigation，sawdust mulch，and enhance(R)biocide affects soft rot incidence，and ower and tuber production of calla［J］.New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2000，28:225-231.

［9］FUNNELL K，AMACKAY B R.Directions and challenges of the New Zealand calla industry，and the use of calcium to control soft rot［C］//SHEEN T F，CHEN J J，YANG T C，et al.The international symposium on development of bulbous flower industry.Taiwan:TSIPS，1999.

［10］賈云鶴，張俊華，崔崇士.軟腐歐文氏菌致病性的研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(1):113-118.

［11］WRIGHT P.A soft rot of calla(Zantedeschia spp.)caused by Erwinia carotovora subsp.carotovora［J］.New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，1998，26:331-334.

［12］BELL K S，AVROVA A O，HOLEVA M C，et al.Sample sequencing of a selected region of the genome of Erwinia carotovora subsp.atroseptica reveals candidate phytopathogenicity genes and allows comparison with Escherichia coli［J］.Microbiology，2002，148:1367-1378.

［13］CHARKOWSKI A O.The soft Ewinia［M］//GNANAMANICKAM S S.Plant-associated bacteria.Netherlands:Springer，2006.

［14］DONG Y H，WANG L H，XU J L，et al.Quenching quorum sensing dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase［J］.Nature，2001，411:813-817.

［15］CAI T，CAI W，ZHANG J，et al.Host legume-exuded antimetabolites optimize the symbiotic rhizosphere［J］.Molecular Microbiology，2009，10:1-11.

［16］HOANG T T，KARKHOFF-SCHWEIZER R R，KUTCHMA A J，et al.A broad-host-range Flp-FRT recombination system for sitespecific excision of chromosomally-located DNA sequences:application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants［J］.Gene，1998，212:77-86.

［17］KOVACH M E，ELZER P H，HILL D S，et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS，carrying different antibiotic-resistance cassettes［J］.Gene，1995，166:175-176.

［18］ARETUSA A E，SILVA L P，PEREIRA J L，et al.In vivo proteome analysis of Xanthomonas campestris pv.campestris in the interaction with the host plant Brassica oleracea［J］.Federation of European Microbiological Societies，2008，1:167-174.

［19］TOOLE G A，KOLTER R.Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple，convergent signaling pathway:a geneticanalysis［J］.Molecular Microbiology，1998，28:449-461.

［20］YI X，YAMAZAKI A，BIDDLE E，et al.Genetic analysis of two phosphodiesterases reveals cyclic diguanylate regulation of virulence factors in Dickeya dadantii［J］.Molecular Microbiology，2010，77(3):787-800.

［21］LI H Y，WANG J S.Release of active oxygen species from phytopathogenic bacteria and their regulation［J］.Chinese Science Bulletin，1999，44(1):71-75.

［22］CORT S A，IMLAY A J.Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defence［J］.Bacteriol，1998，180(6):1402-1410.

［23］MIJAN HOSSAIN M D，SHIBATA S，AIZAWA S I，et al.Motility is an important determinant for pathogenesis of Erwinia carotovora subsp.carotovora［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，2005，66:134-143.

［24］XU Y，ZHU X F，ZHOU M G，et al.Status of streptomycin resistance development in Xanthomanas oryzar pv.oryzae and Xanthomonas oryzae pv.oryzicola in China and their resistance characters［J］.J Phytopathol，2010，158:601-608.

［25］MINGEOT-LECLERCQ M P，GLUPCZYNSKI Y，TULKENS P M.Aminoglycosides:activity and resistance［J］.Antimicrob A-gents Chemother，1999，43(4):727.

［26］YANG B H，BRAND J M，GRAY J S S，et al.Extracellular polysaccharides of modified strains of Eewinia spp.［J］.Carbohydate Research，2001，333:295-302.

［27］MARITS R，KOIV V，LAASIKE，et al.Isolation of an extracellular protease gene of Erwinia carotovora subsp.carotovora strain SCC3193 by transposon mutagenesis and the role of protease in phytopathogenicity［J］.Microbiol，1999，145:1959-1966.