徐小波， 陳 哲， 章熙霞， 袁詠剛， 王 秀， 邢光東， 方津津

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2.南京市畜牧家禽科學(xué)研究所，江蘇 南京 210036)

在養(yǎng)豬業(yè)中，繁殖性狀具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但繁殖性狀的遺傳力較低，傳統(tǒng)的表型選擇效果不理想，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛轉(zhuǎn)向?qū)ふ遗c繁殖性狀關(guān)聯(lián)的基因或者分子標(biāo)記［1］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十個(gè)豬繁殖相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs)，如雌激素受體(ESR)基因［2］、催乳素受體(PRLR)基因［3］和促卵泡素 β 基因(FSHβ)［4］等，這些基因都不同程度地影響豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)以及初生質(zhì)量等繁殖性狀。

ESR、PRLR和 FSHβ基因在民豬、金華豬等地方豬種和長(zhǎng)白、大白等國(guó)外豬種中都有報(bào)道，但尚未見在山豬中的報(bào)道。山豬是江蘇省畜禽遺傳資源保護(hù)品種，主要分布于寧鎮(zhèn)揚(yáng)等丘陵山區(qū)，具有瘦肉率高、肉質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)仔數(shù)多、體質(zhì)好、抗病抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性。由于上世紀(jì)外來(lái)豬種的大力推廣，山豬被人為棄養(yǎng)，目前純種山豬數(shù)量較少，盡快挖掘山豬繁殖性狀遺傳優(yōu)勢(shì)并應(yīng)用于育種工作，已經(jīng)是迫在眉睫。本試驗(yàn)研究ESR、PRLR和FSHβ基因多態(tài)性對(duì)山豬繁殖性狀的效應(yīng)，以期為山豬的遺傳資源保存和分子標(biāo)記輔助選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)豬群

試驗(yàn)豬為南京市畜牧家禽研究所試驗(yàn)豬場(chǎng)山豬育種核心群二胎以上經(jīng)產(chǎn)母豬60頭，所有種豬均有清晰的系譜和每窩產(chǎn)仔哺育記錄，仔豬斷奶時(shí)間為35 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 PCR擴(kuò)增引物合成及DNA測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成;DNA回收純化試劑盒和小量質(zhì)粒純化試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司;Premix Ex Taq聚合酶、pMD18-T Vector等均購(gòu)自大連寶生物公司;限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自北京NEB公司。

1.2.2 DNA提取 活體采樣，用耳號(hào)鉗取耳組織樣約10 mg浸泡在裝有70%乙醇的EP管內(nèi)，－20℃凍存。采用苯酚法提取DNA。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì) ESR［5］、PRLR［6］和 FSHβ［4］基因多態(tài)位點(diǎn)引物(表 1)經(jīng)去離子水溶解后，－20℃保存待用。

表1 候選基因引物序列Table 1 Primers designed for candidate genes

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系 PCR反應(yīng)總體系25.0 μl，Premix Ex Taq 12.5 μl，上、下 游 引 物 (100 μmol/L)各 0.5 μl，模板 DNA 1.0 μl，加滅菌雙蒸水至總反應(yīng)體積25.0 μl。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性 30 s，Tm復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后置于4℃保存。

1.2.5 酶切反應(yīng) 除FSHβ基因擴(kuò)增產(chǎn)物直接電泳外，ESR和PRLR基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別用PvuⅡ和AluⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系:2.0 μl 10 ×NEB 緩沖液，0.2 μl 100 ×BSA，0.5 μl內(nèi)切酶，PCR 產(chǎn)物 5.0 μl，加超純水至 20.0 μl。酶切反應(yīng)條件37℃，反應(yīng)時(shí)間4～6 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用POPGENE1.32軟件計(jì)算基因型和等位基因頻率，并進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡性檢驗(yàn)。采用統(tǒng)計(jì)模型Y=μ+α+e分析基因型對(duì)性狀的效應(yīng)，其中Y為性狀值，μ為總體平均數(shù)，α為基因型效應(yīng)值，e為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果

2.1 ESR、PRLR和FSHβ基因在山豬中的基因型和等位基因頻率

ESR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度120 bp，酶切后出現(xiàn)多態(tài)性(圖1)，出現(xiàn)120 bp條帶的為AA型，出現(xiàn)65 bp和55 bp的為BB型，同時(shí)出現(xiàn)120 bp、65 bp和55 bp的為AB型。

圖1 山豬ESR基因PCR-RFLP檢測(cè)Fig.1 PCR-RFLP of ESR gene in Shan pig

PRLR基因PCR產(chǎn)物長(zhǎng)170 bp，AluⅠ酶切后出現(xiàn)多態(tài)性(圖2)，同時(shí)出現(xiàn)85 bp、59 bp和19 bp 3條條帶的為AA型，出現(xiàn)104 bp和59 bp的為BB型，同時(shí)出現(xiàn)104 bp、85 bp、59 bp和19 bp 4條條帶的為AB型。

圖2 山豬PRLR基因PCR-RFLP檢測(cè)Fig.2 PCR-RFLP of PRLR gene in Shan pig

FSHβ基因是由于插入了一個(gè)長(zhǎng)度為292 bp的逆轉(zhuǎn)座子造成該基因位點(diǎn)的多態(tài)性，PCR產(chǎn)物只出現(xiàn)500 bp條帶的為AA型，只出現(xiàn)220 bp的為BB型，同時(shí)出現(xiàn)500 bp和220 bp的AB型(圖3)。

圖3 山豬FSHβ基因PCR電泳檢測(cè)Fig.3 PCR of FSHβ gene in Shan pig

山豬ESR、PRLR和FSHβ基因的基因型和基因頻率分布見表2。經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，山豬群體內(nèi)ESR各基因型分布不符合哈迪-溫伯格平衡(P＜0.05);PRLR各基因型的分布符合哈迪-溫伯格平衡(P＞0.05);FSHβ基因只發(fā)現(xiàn)AA型和AB型2種基因型，沒(méi)發(fā)現(xiàn)BB型，其中AA基因型頻率最高，為0.567，不符合哈迪－溫伯格平衡(P＜0.05)。ESR基因的A等位基因頻率低于B等位基因頻率，F(xiàn)SHβ和PRLR基因的A等位基因頻率均高于B等位基因頻率。

表2 ESR、PRLR和FSHβ基因的基因型頻率和等位基因頻率分布Table 2 Gene and genotype frequencies of ESR，PRLR and FSHβ genes in Shan pig

2.2 ESR、PRLR和FSHβ基因多態(tài)性與山豬產(chǎn)仔性能

分別統(tǒng)計(jì)ESR、PRLR和FSHβ基因各基因型頭胎和二胎的總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)和產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)見表3。ESR基因BB型是產(chǎn)仔性能優(yōu)勢(shì)基因型，BB型個(gè)體的頭胎及二胎的TNB和NBA均顯著高于AB型(P＜0.05)和AA型(P＜0.01);AB型的頭胎NBA顯著高于 AA型(P＜0.05)，二胎的 TNB和NBA均顯著高于AA型(P＜0.01)。PRLR基因AA型為有利基因型，其效應(yīng)為AA＞AB＞BB，AA型和AB型頭胎和二胎的TNB和NBA均極顯著高于BB型(P＜0.01)，AA型和AB型之間差異不顯著(P＞0.05)。FSHβ基因在山豬群體內(nèi)只有AA型和AB型，AA型頭胎TNB和NBA及二胎NBA均顯著高于AB型(P＜0.05)，AA型二胎TNB極顯著高于AB型(P＜0.01)。

表3 ESR、PRLR和FSHβ基因不同基因型的總產(chǎn)仔數(shù)與產(chǎn)活仔數(shù)Table 3 Total number of born and number of born alive of pigs with different genotypes of ESR，PRLR and FSHβ genes

2.3 ESR、PRLR和FSHβ基因多態(tài)性與仔豬初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量的關(guān)系

分別統(tǒng)計(jì)ESR、PRLR和FSHβ基因各基因型頭胎和二胎產(chǎn)仔的初生質(zhì)量(BW)和斷奶質(zhì)量(WW)見表4。可見，ESR基因AA型是仔豬體質(zhì)量?jī)?yōu)勢(shì)基因型，對(duì)BW性狀，其效應(yīng)排序?yàn)锳A＞BB＞AB;對(duì)WW性狀，其效應(yīng)排序?yàn)锳A＞AB＞BB;具體表現(xiàn)為AA型的頭胎和二胎的BW均顯著高于AB和BB型(P＜0.05);AA型的頭胎和二胎的WW顯著高于BB型(P＜0.05)。PRLR基因BB型為仔豬體重優(yōu)勢(shì)基因型，對(duì)BW和WW性狀，其效應(yīng)排序均為BB＞AB＞AA;其中BB型頭胎和二胎仔豬的WW均顯著高于 AA型(P＜0.05)，其余差異不顯著(P＞0.05)。FSHβ基因只有AA型和AB型，AB型頭胎和二胎BW和WW均高于AA型(P＞0.05)。

表4 ESR、PRLR和FSHβ基因不同基因型的初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量Table 4 Birth weight and weaning weight of pigs with different genotypes of ESR，PRLR and FSHβ genes

3 討論

3.1 各候選基因多態(tài)性及群體遺傳分析

陳克飛等［7］研究發(fā)現(xiàn)ESR基因的B等位基因在國(guó)內(nèi)豬種占優(yōu)勢(shì)(0.73)，而國(guó)外豬種內(nèi)A等位基因頻率較高(0.66)。在山豬群體中，本研究得到與以往結(jié)論相同的結(jié)果。趙要風(fēng)等［4］在二花臉和香豬內(nèi)只發(fā)現(xiàn)了FSHβ基因的 A等位基因，徐寧迎等［8］在金華豬Ⅰ系內(nèi)發(fā)現(xiàn) B等位基因頻率極低(0.012)，在Ⅱ系和Ⅲ系內(nèi)只發(fā)現(xiàn)A等位基因。本研究中未發(fā)現(xiàn)FSHβ基因的BB基因型，B等位基因頻率為0.22。就PRLR基因而言，本研究所得結(jié)果與李婧等［9］的研究結(jié)果一致。群體的遺傳平衡檢測(cè)結(jié)果表明，山豬并未處于穩(wěn)定遺傳平衡狀態(tài)。

3.2 各候選基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性

ESR基因是較早發(fā)現(xiàn)的豬產(chǎn)仔數(shù)性狀主效基因，許多研究認(rèn)為每個(gè)B等位基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)的效應(yīng)為0.3 ～1.5 頭/胎［2，10-11］。對(duì)地方豬種姜曲豬、小梅山豬及二花臉豬的研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的效應(yīng)均達(dá)到極顯著水平，每個(gè)B等位基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的加性效應(yīng)分別為1.52和 1.50頭/胎［10］。本研究中，山豬群體 ESR基因BB型是優(yōu)勢(shì)基因型，B等位基因頻率達(dá)到0.817，與大多數(shù)國(guó)內(nèi)豬種的報(bào)道比較一致［7］。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)ESR基因BB基因型個(gè)體頭胎和二胎的總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)均顯著高于AA型個(gè)體(P＜0.01)。推測(cè)山豬與其他地方豬種一樣有較高的繁殖性能的潛力。

趙要風(fēng)等［4］提出FSHβ是控制豬產(chǎn)仔性狀主效基因，AA基因型是國(guó)內(nèi)豬種的優(yōu)勢(shì)基因型，可以明顯提高產(chǎn)仔數(shù)［4，9，12］，但 Korwin-Kossakowska 等［13］報(bào)道中FSHβ基因的作用卻是不顯著的。本研究的山豬群體內(nèi)，B等位基因頻率很低，和其他國(guó)內(nèi)地方豬種的基因分布趨勢(shì)相近［11-12，14］，但本研究發(fā)現(xiàn) AA型的頭胎和二胎的總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)均略高于AB型，A等位基因是優(yōu)勢(shì)基因。由于本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)BB型個(gè)體，可能由于山豬遺傳資源嚴(yán)重流失導(dǎo)致，因此FSHβ基因?qū)ι截i繁殖性狀的作用有待后期繼續(xù)測(cè)定。

國(guó)內(nèi)外不同學(xué)者對(duì)不同豬種的研究發(fā)現(xiàn)PRLR基因與產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，A等位基因能顯著提高產(chǎn)仔數(shù)［15-16］;另一部分研究者則認(rèn)為BB基因型對(duì)豬產(chǎn)仔數(shù)更有利［6，17］。前人的研究成果說(shuō)明PRLR多態(tài)性與繁殖性能存在相關(guān)性，但其在不同豬種中的多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)系尚無(wú)定論。本研究與李婧等［11］的研究結(jié)果一致，PRLR基因的A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，AA基因型產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于BB基因型個(gè)體。

3.3 各候選基因多態(tài)性與初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量的相關(guān)性

關(guān)于ESR、PRLR和FSHβ基因?qū)ψ胸i初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量的影響，目前還沒(méi)有定論。部分研究認(rèn)為ESR、PRLR和FSHβ基因?qū)ψ胸i初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量沒(méi)有顯著影響［18-19］，但是胡雪松等［20］發(fā)現(xiàn)，PRLR基因?qū)?guó)內(nèi)豬種和國(guó)外豬種初生質(zhì)量作用顯著不同。本研究中，PRLR基因?qū)︻^胎和二胎仔豬的斷奶質(zhì)量效應(yīng)顯著，ESR基因?qū)︻^胎、二胎的初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量均有顯著影響。謝保勝［21］的研究結(jié)果表明，金華豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)與初生質(zhì)量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，本研究中，山豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)與初生質(zhì)量的遺傳關(guān)系也有相似趨勢(shì)。這一結(jié)果為山豬的分子標(biāo)記輔助選育過(guò)程提供了新的的依據(jù)和參考。

繁殖性狀是個(gè)數(shù)量性狀，受微效多基因調(diào)控，同時(shí)也受到胎次、管理、營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)環(huán)境的影響。山豬遺傳資源較為稀少，今后還應(yīng)該通過(guò)擴(kuò)大樣本的數(shù)量做深入的研究，為遺傳效應(yīng)評(píng)價(jià)提供更有說(shuō)服力的依據(jù)。因此，目前同時(shí)考慮幾個(gè)繁殖性狀基因的協(xié)同作用進(jìn)行分子育種也許更為可取。

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