胚齡、激素對小麥單倍體萌發(fā)率及成苗率的影響

孫蘇陽， 王永軍， 李海軍， 李麗麗， 蔣學(xué)祥

(江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院矮敗小麥育種技術(shù)創(chuàng)新中心＜淮安＞，江蘇 淮安 223001)

常規(guī)的小麥品種選育，一般需要5～8年才能形成農(nóng)藝性狀相對整齊一致的穩(wěn)定群體。如果進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，由于雜種后代瘋狂分離，則品種純化需要更長的時間。小麥單倍體育種是將單倍體染色體加倍獲得純合雙單倍體。通常雙單倍體在一個世代中就可以得到純合的重組體，這對于縮短小麥品種育種年限，提高育種效率很有意義。

自1964年人們經(jīng)過花藥離體培養(yǎng)獲得單倍體后，應(yīng)用單倍體技術(shù)進(jìn)行品種改良迅速發(fā)展。但對于普通小麥而言，這種產(chǎn)生單倍體的方法，不僅成苗率低，而且會產(chǎn)生大量的白化苗。1975年Barely［1］用普通小麥與球莖大麥雜交獲得了高頻率的小麥單倍體，但后來的研究表明普通小麥與球莖大麥之間的雜交存在不親和性，并已證明這種不親和性是由于位于小麥5B染色體長臂上的Kr1基因和5A染色體長臂上的Kr2基因有阻止小麥與異源植物交配的功能，從而限制了該法在小麥育種上的應(yīng)用。1984年德國學(xué)者Zenkteler［2］最早報道了玉米花粉誘導(dǎo)小麥獲得球形胚的研究結(jié)果，但無細(xì)胞學(xué)證明。1986年Laurie等［3］進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)觀察，證明了小麥與玉米雜交后，在最初的3次細(xì)胞分裂中，來自父本玉米的染色體被完全排除掉，形成了僅有21條母本小麥染色體的單倍體胚。進(jìn)一步研究表明，小麥×玉米的受精頻率不受小麥所攜帶的Kr1、Kr2基因的影響，說明Kr基因在小麥與玉米雜交中是不敏感的［4］。1988年，Laurie等［5］利用小穗培養(yǎng)法獲得了小麥×玉米產(chǎn)生的單倍體植株。因此利用小麥×玉米誘導(dǎo)單倍體是一種有效的單倍體育種方法。

適宜的胚齡對幼胚的培養(yǎng)十分重要，而不同的學(xué)者對此研究結(jié)果不盡相同［6-8］，胚齡從11～16 d不等。呂國鋒等［6］在用1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)幼胚時不添加任何激素，而蔡黎明［9］研究認(rèn)為在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L IAA及0.2 mg/L 6-BAP的培養(yǎng)效果較不添加激素的效果好。本試驗(yàn)擬通過研究不同胚齡以及1/2MS培養(yǎng)基中激素的有無對幼胚萌發(fā)率和成苗率的影響，以期確定本地區(qū)適宜幼胚離體培養(yǎng)的最佳胚齡及培養(yǎng)基，使這種單倍體育種方法最大程度地發(fā)揮其作用。

1 材料與方法

1.1 材料

父本玉米花粉供體為江南花糯和蜜玉1號兩個雜交種的混合花粉。母本為(西農(nóng)979×淮麥18)F1、(西農(nóng)979×淮麥24)F1、(小偃6號×淮麥19)F1、(小偃6號×淮麥24)F1和太谷核不育小麥的6種不育株后代。小麥于2011年10月10日播種，玉米在塑料大棚內(nèi)分5期播種，分別為2011年12月4日、12月24日，2012年1月14日、2月8日和2月21日，以調(diào)節(jié)小麥和玉米的花期。胚齡以玉米第1次授粉到剝?nèi)》f果的天數(shù)計。試驗(yàn)在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地實(shí)施。

1.2 小麥與玉米雜交

小麥抽穗后對常規(guī)雜交種進(jìn)行剪穎、去雄、套袋，對太谷核不育的不育株剪穎套袋。小麥開花時采集新鮮的玉米花粉給小麥逐花授粉，第1次授粉后24 h進(jìn)行第2次重復(fù)授粉。2，4-D的處理參照姚景俠［10］的方法，第1次授粉24 h后向小麥柱頭上用微量噴霧器噴灑100 mg/kg的2，4-D溶液1.5 ml，48 h 后再次用 100 mg/kg的 2，4-D 溶液 1.5 ml處理一次。

1.3 幼胚離體培養(yǎng)

將玉米第1次授粉后13～20 d的雜交穗取回，小心剝?nèi)》f果。在超凈工作臺上先用70%酒精表面滅菌30 s，然后用0.1%的升汞滅菌10～15 min，無菌水沖洗3～4次，解剖鏡下剝?nèi)∮着?，接入培養(yǎng)基處理。培養(yǎng)基設(shè)2種不同處理:不添加任何激素的1/2 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8;1/2 MS+0.2 mg/L 6-BAP+0.2 mg/L IAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8。25℃下暗培養(yǎng)，待幼胚萌發(fā)后置于20℃、16 h/d光照條件，大約14 d后觀察幼胚的萌發(fā)和成苗情況。

萌發(fā)率=(幼胚萌發(fā)數(shù)/接種胚數(shù))×100%;成苗率=(成苗數(shù)/接種胚數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同胚齡對單倍體萌發(fā)率及成苗率的影響

小麥單倍體胚齡為 15～19 d，萌發(fā)率從 74.4%～100.0%不等。從圖 1 可見，胚齡為 15 d、16 d、17 d、18 d、19 d的小麥單倍體幼胚平均萌發(fā)率分別為92.1%、93.8%、98.3%、94.1%和74.4%。小麥幼胚萌發(fā)率隨著胚齡的增加而相應(yīng)提高，并在胚齡為17 d時達(dá)到最大，隨后下降，在胚齡為19 d時，萌發(fā)率最低。

圖1 胚齡對小麥單倍體幼胚萌發(fā)率的影響Fig.1 Effects of embryo age on germination rate of haploid from wheat×maize

胚齡為15～19 d的小麥幼胚成苗率從16.3% ～64.4%不等。由圖 2 可見，胚齡為 15 d、16 d、17 d、18 d、19 d 的小麥幼胚平均成苗率分別為51.3%、64.4%、62.4%、20.1%和16.3%?？梢姡←溣着叱擅缏孰S著胚齡的增加相應(yīng)提高，并在16 d時達(dá)到最大，隨后，成苗率開始下降但較為緩慢，胚齡為17 d后，成苗率急劇下降。

圖2 胚齡對小麥單倍體幼胚成苗率的影響Fig.2 Effects of embryo age on seedling rate of haploid from wheat×maize

2.2 激素對幼胚萌發(fā)及成苗的影響

胚齡同為16 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌發(fā)率分別為 100.0%、92.8%，成苗率分別為71.5%、78.6%;胚齡同為17 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌發(fā)率同為100.0%，成苗率分別為60.0%、71.4%;胚齡同為18 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌發(fā)率分別為82.1%、100.0%，成苗率分別為6.8%、33.3%。表明，培養(yǎng)基中沒有添加激素的不育株成苗率較添加的高，但添加激素與否對萌發(fā)率的影響結(jié)果不一致。

3 討論

胚齡的大小對幼胚的離體培養(yǎng)十分重要。從本研究可以看出，胚齡從15 d到17 d，隨著胚齡的增加其胚的萌發(fā)率提高，此后開始下降，至19 d時萌發(fā)率最低;成苗率在胚齡為16 d時達(dá)到最大，從17 d時開始急劇下降，這一結(jié)果基本與呂國鋒等人［6］的研究相同。可見，胚齡為16 d時，其萌發(fā)率和成苗率較高，是較為合適的幼胚培養(yǎng)時期。

蔡黎明［9］研究認(rèn)為，1/2MS培養(yǎng)基中添加 0.2 mg/L IAA和0.2 mg/L 6-BAP的培養(yǎng)效果較不添加激素的效果好，但本試驗(yàn)的結(jié)果卻是不加激素的材料其成苗率較添加0.2 mg/L IAA和0.2 mg/L 6-BAP的成苗率高。IAA和6-BAP分別起促進(jìn)生根及促使嫩芽分化的作用，如果濃度不適宜則起不到作用。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，0.2 mg/L可能不是最適宜小麥單倍體胚的激素濃度才導(dǎo)致其成苗率不如不添加激素的效果好，因此關(guān)于適宜的激素濃度還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］BARELY I R.High frequencies of haploid production in wheat by chromosome［J］.Nature，1975，256:410-411.

［2］ZENKTELER M，NITZSCHE W.Wide hybridization experiments in cereals［J］.Theor Appl Genet，1984，68:311-315.

［3］LAURIE D A.Wheat × maize hybridization［J］.Can J Genet Cytol，1986，28:313-316.

［4］LAURIE D A，BENNET M D.The production of haploid wheat plants from wheat× maize crosses［J］.Theor Appl Genet，1988，78:393-397.

［5］LAURIE D A，BENNET M D.The effect of the crossability of Kr1 and Kr2 on fertilization frequency in bihaploid wheat×maize crosses［J］.Theor Appl Genet，1987，73:403-409.

［6］呂國鋒，范金萍，高德榮，等，胚齡對小麥×玉米單倍體植株產(chǎn)生的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，19(1):59-60.

［7］陳新民，陳 孝，徐惠君，等.利用小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥單倍體的研究［C］//莊巧生，杜振華.中國小麥育種研究進(jìn)展(1991 ～1995).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997:510-518.

［8］末永一博.與玉米雜交獲得小麥雙單倍體系統(tǒng)的方法［J］.國外農(nóng)學(xué)——麥類作物，1991(4):29-31.

［9］蔡黎明.小麥單倍體幼胚離體培養(yǎng)研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22(7):313-315.

［10］姚景俠，李浩兵，鐘少斌，等.小麥與玉米雜交及單倍體的產(chǎn)生［J］.植物學(xué)通報，1995，12(3):31-35.