楊繼偉，曲彥志，崔麗洋，毛熙嵐，劉宗華，李浩川

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450002)

玉米單倍體只含有1套染色體組，在減數(shù)分裂過(guò)程中不能形成正常的配子，因而表現(xiàn)出高度不育，無(wú)法直接利用，只有通過(guò)染色體成功加倍，產(chǎn)生所有等位基因純合、正?？捎?DH)系后，才能用于玉米育種。近年來(lái)，由于單倍體育種逐步彰顯其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)的相關(guān)研究越來(lái)越深入，從誘導(dǎo)基因的克隆和誘導(dǎo)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)[1-2]，到新型高頻率孤雌生殖誘導(dǎo)系的選育[3-4]及高效自動(dòng)化單倍體分選儀的成功研制[5]，使單倍體產(chǎn)生和鑒定效率得到了大幅度提高，極大地推動(dòng)了該技術(shù)的規(guī)?；瘧?yīng)用。然而，單倍體不能高效地成功加倍已是單倍體育種技術(shù)工程化應(yīng)用的瓶頸。目前，化學(xué)藥劑處理是單倍體加倍的主要方法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工，加倍過(guò)程也比較繁瑣，所利用的化學(xué)藥劑常常對(duì)人體和環(huán)境造成較大的危害[6]。所以，實(shí)現(xiàn)玉米單倍體育種規(guī)?；凸こ袒枰剿鞲咝?、簡(jiǎn)便、快捷的單倍體加倍途徑。為此，對(duì)單倍體育性自然恢復(fù)的表現(xiàn)和影響因素以及育性自然恢復(fù)的有關(guān)機(jī)制進(jìn)行了綜述，以期為玉米單倍體育種提供借鑒。

1　玉米單倍體育性表現(xiàn)

1.1　玉米單倍體雄穗自然恢復(fù)

單倍體植株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中能正常抽雄，由于只含有1套染色體組，表現(xiàn)高度不育，即使單倍體中的10條染色體在減數(shù)分裂過(guò)程中同時(shí)進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生可育配子的概率也只有1/512，但在育種實(shí)踐過(guò)程中發(fā)現(xiàn),不同遺傳背景的單倍體存在著不同程度的育性恢復(fù)，有的單倍體僅僅有一個(gè)或者幾個(gè)小穗能夠散粉，有的是一個(gè)或者幾個(gè)分支，也有少數(shù)的單倍體整個(gè)雄穗都可以散粉，這可能與單倍體細(xì)胞二倍化的早晚和程度有關(guān)，為單倍體的自然加倍提供了可能性[7]。Khoklov等[8]報(bào)道了單倍體在沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理或者物理因素影響下，二倍體細(xì)胞存在單倍體植株的任何部位組織，最多的組織細(xì)胞中二倍體細(xì)胞比例達(dá)到1.23%，并認(rèn)為這是自然加倍的結(jié)果?？梢?jiàn)，自然狀態(tài)下單倍體體細(xì)胞也具有一定的二倍化傾向。Chase[9]、魏俊杰等[10]分別對(duì)單倍體雄穗自然恢復(fù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明,自然恢復(fù)率在10%左右，不同基因型之間差異顯著，變異系數(shù)達(dá)50%。也有研究表明,有的單倍體材料不具有自然二倍化的能力[11]。Shatskaya等[12]研究認(rèn)為,單倍體雄穗的可育性程度是遺傳性狀，基因型來(lái)源不同的單倍體雄穗育性恢復(fù)能力差異很大，并在4個(gè)不同來(lái)源的單倍體材料發(fā)現(xiàn)雄穗育性恢復(fù)率具有顯著性的差異。

1.2　玉米單倍體雌穗自然恢復(fù)

Chalyk[7]利用來(lái)自10個(gè)馬齒型玉米的234個(gè)單倍體植株，并與混合的正常二倍體的花粉進(jìn)行雜交授粉，其中僅有8個(gè)果穗未結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)最多的果穗可達(dá)到127粒，平均每個(gè)果穗結(jié)實(shí)26.6個(gè)籽粒。Geiger等[13]利用3個(gè)單倍體群體采取開(kāi)放式和二倍體植株花粉授粉的方法觀察單倍體雌穗結(jié)實(shí)特性，發(fā)現(xiàn)最高單倍體結(jié)實(shí)數(shù)要超出平均每穗的結(jié)實(shí)粒數(shù)的3～6倍，其中第一個(gè)群體平均結(jié)實(shí)25～192粒。魏俊杰等[10]、劉志增等[14]研究結(jié)果也都表明，單倍體雌穗育性自然恢復(fù)率都達(dá)到90%以上。任姣姣[15]利用鄭單958的花粉對(duì)不同來(lái)源的22個(gè)自交系的單倍體的雌穗進(jìn)行多次重復(fù)授粉，分析單倍體雌穗育性的恢復(fù)能力，結(jié)果表明，單倍體雌穗平均結(jié)實(shí)株率為89.54%，平均結(jié)實(shí)籽粒數(shù)為15.4個(gè)。由此可見(jiàn)，單倍體雌穗自然恢復(fù)為二倍化的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雄穗，因此，單倍體雌穗育性自然恢復(fù)能力不是限制單倍體自然加倍的主要因素。

2　玉米單倍體自然恢復(fù)影響因素

2.1　母本遺傳背景的影響

單倍體自然加倍能力受母本材料基因型控制，研究結(jié)果表明，不同來(lái)源材料的單倍體，雄花自然恢復(fù)率不足5%，有的材料甚至不具有自然加倍的能力[11-12]。Chalyk[7]研究表明，單倍體雄穗育性自然恢復(fù)在不同單倍體材料間也存在顯著差異，不同基因型的自然加倍效率大約在0%～21.4%。許洛等[16]對(duì)5個(gè)來(lái)自國(guó)外血緣不同雜交種的單倍體進(jìn)行自然恢復(fù)研究，結(jié)果表明，單倍體育性差異顯著，最高散粉率為13.8%，最低僅為0.57%，先玉808、MSD1和DMY1為自然加倍效果較好的材料。Shatskaya等[12]對(duì)613/2C4、Mol7、Ts8、Tsl6的單倍體進(jìn)行研究，4個(gè)不同材料的單倍體雄穗育性自然恢復(fù)率分別是21.9%、1.2%、5.3%、3.4%。Kleiber等[17]在對(duì)早熟和溫帶2種不同玉米種質(zhì)資源的單倍體自然加倍率的研究中，發(fā)現(xiàn)早熟種質(zhì)來(lái)源的單倍體育性恢復(fù)效率高于晚熟品種，對(duì)于溫帶種質(zhì)類(lèi)型的材料，單倍體來(lái)源于骨干種質(zhì)的散粉率及結(jié)實(shí)率比來(lái)源地方種質(zhì)的高。

2.2　生態(tài)環(huán)境的影響

單倍體的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)其自然恢復(fù)效率也有極大的影響。Kleiber等[17]在大田和溫室2種不同環(huán)境中利用當(dāng)?shù)赜衩踪Y源和熱帶玉米種質(zhì)資源的單倍體對(duì)其育性恢復(fù)效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，在溫室條件下單倍體的平均恢復(fù)率要遠(yuǎn)高于大田單倍體的自然恢復(fù)率。許洛等[16]利用5份不同基因型材料的單倍體在石家莊春播和夏播以及海南冬播3個(gè)環(huán)境條件下對(duì)其單倍體自然加倍的效果進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型材料間，不同生態(tài)環(huán)境下加倍效果差異顯著，海南冬播效果最好，其次為石家莊春播。段民孝等[18]和蔡泉等[19]也證明了甘肅和海南兩地的單倍體的自然加倍效率顯著高于黃淮海地區(qū)和東北地區(qū)。甘肅和海南單倍體自然加倍之所以效果較好，可能是因?yàn)閮傻貐^(qū)整體氣溫相對(duì)比較穩(wěn)定，尤其是在植株生殖器官?gòu)纳L(zhǎng)到成熟階段，不會(huì)經(jīng)受較高的溫度，而且晝夜溫差比較大，有利于單倍體生殖生長(zhǎng)的發(fā)育。劉志增等[14]的研究也表明在單倍體生長(zhǎng)前期晝夜溫差的變化與單倍體雄穗育性恢復(fù)有顯著的相關(guān)趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，選擇合適的種植環(huán)境，可以提高單倍體的育性恢復(fù)效率。

2.3　播期的影響

單倍體自然加倍還與播種時(shí)間有一定的關(guān)系，尤其在同一個(gè)區(qū)域內(nèi)，不同播種時(shí)間對(duì)單倍體育性恢復(fù)有顯著的差異。王文潔等[20]在河南新鄉(xiāng)利用同一個(gè)材料的單倍體探索了10個(gè)不同播期對(duì)單倍體自然加倍的影響，結(jié)果表明，不同的播期對(duì)單倍體加倍率有明顯差異，在該地區(qū)4月27日至5月2日有利于單倍體自然加倍，加倍率在57%左右。劉德友等[21]在山東青島研究了不同基因型不同播期對(duì)玉米單倍體自然加倍的影響，結(jié)果表明，不同基因型單倍體自然散粉率差異很大，自然散粉率為6.56%～65.33%；夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交結(jié)實(shí)率為6.23%～9.39%，比春播高2.37%；夏播更有利于單倍體自然散粉和自交結(jié)實(shí)。段民孝等[22]在華北地區(qū)研究19個(gè)玉米單倍體在春、夏播不同播種期對(duì)自然加倍率的影響，結(jié)果表明，該地區(qū)春播時(shí)期更利于玉米單倍體的自然加倍。單倍體育性自然恢復(fù)受環(huán)境影響較大。由于我國(guó)地域廣闊，不同地區(qū)的氣候環(huán)境相差很大，導(dǎo)致不同地區(qū)的最佳播種時(shí)期不一致，所以在選擇正確的播種地點(diǎn)的同時(shí)，也要考慮播種日期對(duì)單倍體自然加倍的影響，方可達(dá)到更好的加倍效果。

2.4　其他因素的影響

單倍體育性恢復(fù)不僅受到基因型和環(huán)境的影響而且還受到其他因素的影響。有研究表明，經(jīng)過(guò)單倍體加倍成功的DH系，再進(jìn)行誘導(dǎo)獲得的單倍體自然恢復(fù)率高達(dá)40%以上[23]，這可能是由于控制單倍體育性恢復(fù)的基因一直存在，導(dǎo)致單倍體自然加倍率較高。由于單倍體植株矮小，生長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較低，尤其是進(jìn)行生殖發(fā)育過(guò)程中，土壤營(yíng)養(yǎng)、田間濕度以及光照時(shí)間和強(qiáng)度都將會(huì)影響到單倍體雄穗是否自然產(chǎn)生可育的花粉和結(jié)實(shí)率，由此可見(jiàn)，單倍體自然加倍受多種因素影響，因此，實(shí)現(xiàn)單倍體加倍基地化和專(zhuān)業(yè)化，提高單倍體加倍效率，是單倍體育種工程化的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

3　玉米單倍體育性自然恢復(fù)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制

利用秋水仙素(Cochicine)[17,24-25]、APM(Amiprophosmethyl)[26]、氨磺樂(lè)靈(Oryzalin)[27]和氟樂(lè)靈(Trifluralin)[28]等化學(xué)藥劑進(jìn)行單倍體化學(xué)加倍，取得了顯著的效果，普遍認(rèn)為其加倍機(jī)制是這些化學(xué)藥劑降解了微管蛋白，抑制了紡錘絲的形成[29]，而紡錘絲在體細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中和生殖細(xì)胞減數(shù)過(guò)程中期起著重要的作用，這種紡錘絲的異?，F(xiàn)象會(huì)造成正常的2個(gè)姐妹染色單體或同源染色體不能正常移向細(xì)胞兩極，從而引起單倍體細(xì)胞染色體加倍。但這些化學(xué)藥劑處理濃度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不僅加重藥害，還會(huì)產(chǎn)生畸形和多倍體現(xiàn)象；反之，處理濃度過(guò)低、時(shí)間太短則達(dá)不到預(yù)期加倍的效果，因此，合適的藥劑濃度和處理時(shí)間至關(guān)重要。

截至目前，玉米單倍體自然恢復(fù)的生物機(jī)制一直不清楚，但是幾乎所有的單倍體植株都存在自發(fā)二倍化的現(xiàn)象。Gayen 等[30]通過(guò)觀察單倍體花粉母細(xì)胞認(rèn)為，單倍體能夠產(chǎn)生可育的花粉，這與細(xì)胞融合有關(guān)。Testillano等[31]對(duì)玉米小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)到5～7 d發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞存在的現(xiàn)象，提出了早期細(xì)胞核的融合是導(dǎo)致單倍體加倍的主要原因。吳鵬昊等[32]利用流式細(xì)胞儀對(duì)鄭單958誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體在自然條件下的二倍化現(xiàn)象進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞加倍與生殖細(xì)胞加倍并不顯著相關(guān)，而雌雄穗加倍存在差異，并且雌穗自然加倍率較高。目前關(guān)于單倍體染色體自然加倍有很多假說(shuō)，比如核內(nèi)復(fù)制、核內(nèi)有絲分裂、花粉管中營(yíng)養(yǎng)核和精子融合等，均可能導(dǎo)致自然加倍發(fā)生[33]。

4　玉米單倍體育性的遺傳機(jī)制

玉米單倍體育性自然恢復(fù)主要體現(xiàn)在雄穗和雌穗2個(gè)方面，早期對(duì)于單倍體雄穗和雌穗育性恢復(fù)沒(méi)有過(guò)多的研究，目前研究結(jié)果表明，單倍體育性自然恢復(fù)是由核基因所控制。吳鵬昊[34]對(duì)多個(gè)不同雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的自交系和雜交種的單倍體進(jìn)行雄穗育性恢復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，該性狀在不同遺傳背景的材料中表現(xiàn)出顯著的差異，并利用2個(gè)育性自然恢復(fù)能力較強(qiáng)的材料與恢復(fù)能力較低的材料進(jìn)行正反交，對(duì)得到的F1的單倍體育性自然恢復(fù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)單倍體都具有恢復(fù)能力，并沒(méi)有顯著性差異，由此可見(jiàn)，單倍體育性自然恢復(fù)性狀不受細(xì)胞質(zhì)基因的影響；又利用鄭單958 F2:3群體的單倍體，通過(guò)多年綜合試驗(yàn)，定位到了控制單倍體雄穗育性自然恢復(fù)的基因位點(diǎn)，共檢測(cè)到8個(gè)有關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中8號(hào)染色體上在不同年份間檢測(cè)到了一個(gè)共同的QTL位點(diǎn)。Ren等[35]利用2個(gè)單倍體雄穗育性恢復(fù)差異明顯的材料組配了F2:3單倍體群體，并通過(guò)多年多點(diǎn)試驗(yàn)，對(duì)不同家系的單倍體雄穗育性觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)合分子數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL分析，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)相關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中3個(gè)QTL位點(diǎn)均在單倍體群體中檢測(cè)到，同時(shí)檢測(cè)到了1個(gè)位于第6染色體的主效QTL，介于IND166和IND1668兩個(gè)標(biāo)記之間。此外，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)也利用分離群體在鄭州和海南2個(gè)不同的環(huán)境下對(duì)單倍體雄穗自然恢復(fù)進(jìn)行QTL分析，檢測(cè)到了3個(gè)共同的QTL與該性狀相關(guān)。隨著研究的不斷深入，控制單倍體雄穗自然恢復(fù)的基因?qū)⒈豢寺。瑸樘岣邌伪扼w自然恢復(fù)能力提供更強(qiáng)的理論支撐。

5　展望

玉米單倍體育種技術(shù)已與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)一起成為現(xiàn)代玉米育種三大核心技術(shù)[36]，高效的玉米單倍體育種技術(shù)體系，將會(huì)大大提升我國(guó)的玉米育種水平，加速突破性品種的培育，提升種子企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。單倍體加倍作為單倍體育種技術(shù)體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尤其是自然加倍，由于具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)勢(shì)，更會(huì)引起高度重視，可以圍繞以下幾個(gè)方面開(kāi)展工作：(1)加強(qiáng)單倍體自然加倍分子機(jī)制的研究，開(kāi)發(fā)出功能標(biāo)記，用于實(shí)踐中，實(shí)現(xiàn)單倍體自然加倍的高效化；(2)探索出不同來(lái)源基因型與加倍環(huán)境的互作效應(yīng)，找出最適合單倍體自然加倍的區(qū)域，實(shí)現(xiàn)單倍體自然加倍的基地化；(3)根據(jù)自然加倍的特點(diǎn)，培訓(xùn)一批技術(shù)人員，熟練掌握基地管理、自然加倍的識(shí)別、自交授粉等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)自然加倍操作的專(zhuān)業(yè)化。隨著研究的不斷深入，研制出高效的玉米單倍體自然加倍技術(shù)，不僅可以確保人員和環(huán)境的安全，還可以減少其他加倍方法繁瑣的過(guò)程，節(jié)省人力物力，節(jié)約育種成本，并將加速玉米單倍體工程化育種進(jìn)程。