惠國強(qiáng)，侯 磊，杜彥超，王秀明，南芝潤，賈聰慧

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，山西忻州034000；2.忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000）

玉米作為世界三大糧食作物之一，2016 年，全世界種植面積約為1.95×108hm2，總產(chǎn)量約為1.10×109t，種植面積和產(chǎn)量均為世界農(nóng)作物的第一；我國玉米種植面積約為3.66×107hm2，總產(chǎn)量約為2.20×108t，種植面積和產(chǎn)量均為我國農(nóng)作物的第一[1]。

單倍體育種技術(shù)在玉米育種中被廣泛應(yīng)用，極大地加快了育種進(jìn)程。常規(guī)選育玉米自交系，獲得純合自交系通常需要經(jīng)過6～8 代。單倍體育種可以明顯地縮短育種年限，純合自交系的獲得一般只需1～2 代自交，育種年限大大縮短[2]。直到20 世紀(jì)40 年代CHASE[3-6]才將選育的優(yōu)良純合DH 系用于商業(yè)雜交種生產(chǎn)。

加倍玉米單倍體主要采用自然加倍、化學(xué)加倍和N2O 氣體加倍等方法。JENSEN[7]和TESTILLANO等[8]研究表明，一個單倍體植株的一小部分體細(xì)胞通過體細(xì)胞融合、核內(nèi)復(fù)制、核內(nèi)有絲分裂或者其他的一些機(jī)制來自然加倍。魏俊杰等[9]在六葉期和拔節(jié)期使用注射法加倍玉米單倍體，結(jié)果表明，不同濃度的秋水仙素溶液，在玉米六葉期的注射效果顯著高于拔節(jié)期。KATO[10-11]研究表明，N2O 具有玉米苗期染色體加倍功能，其采用600 kPa 的N2O 氣體處理8 種不同基因型的六葉期玉米苗2 d，結(jié)果顯示，有44%的植株能自交結(jié)實(shí)。

玉米單倍體加倍的主要方法是化學(xué)加倍，采用的藥劑主要有秋水仙素和除草劑。WAN 等[12-13]用秋水仙素（0.05%和0.025%）處理單倍體愈傷組織24、48、72 h，結(jié)果表明，處理 24 h 后，愈傷組織再生了約50%的單倍體；處理72 h 的愈傷組織中再生的都是雙倍單倍體，除了少數(shù)四倍體，136 株再生植株中有107 株自交結(jié)實(shí)。慈佳賓等[14-15]采用氟樂靈、拿草特2 種除草劑處理玉米單倍體，結(jié)果表明，采用浸種法80 μmol/L 氟樂靈處理20 h，加倍率為35.7%；采用浸芽法 60 μmol/L 拿草特處理 24 h，加倍率為24.8%；采用浸根法40 μmol/L 氟樂靈處理15 h，加倍率為16.8%。

目前，玉米是唯一大規(guī)模培育單倍體的作物，盡管當(dāng)前玉米單倍體加倍技術(shù)取得了長足的進(jìn)展，但是加倍率、散粉率和成活率還是受到一定的限制，自然和化學(xué)加倍率依然偏低?；瘜W(xué)加倍主要采用植株滴心法和種子處理法，這2 種方法技術(shù)繁瑣，加倍效率偏低，且藥劑對環(huán)境污染較嚴(yán)重。

本研究比較了不同濃度（1、5、10、20 μmol/L）的3 種除草劑（甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈）對玉米單倍體成熟胚的加倍效果，以期找到一種玉米單倍體加倍的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

供試玉米雜交種為先玉335、中地88 和鄭單958；玉米單倍體誘導(dǎo)系來源于自選的母本誘導(dǎo)系JY-1；加倍藥劑使用的是98%的甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈3 種除草劑原藥（上海西格瑪- 奧德里奇公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

將試驗材料種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所試驗田。以誘導(dǎo)系作父本、玉米雜交種作母本，進(jìn)行雜交，使用收獲后的單倍體種子，待處理。

1.2.1 制備培養(yǎng)基 取MS 培養(yǎng)基，調(diào)pH 值至5.8～6.0，120 ℃高壓滅菌10 min。使用1%的二甲基亞砜，將甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟樂靈原液分別配制成 1、5、10、20 μmol/L 的溶液，過濾滅菌。倒入適量的培養(yǎng)基至組培瓶。以未加除草劑的MS 培養(yǎng)基為對照。

1.2.2 成熟胚的切取及除草劑處理 無菌水清洗玉米單倍體種子，用75%的酒精浸泡5 min，再用0.1%的氯化汞浸泡10 min，無菌水清洗并浸泡24 h，超凈工作臺下切取單倍體籽粒白色的成熟胚。將成熟胚接入不同濃度的甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟樂靈的組培瓶及對照瓶，暗培養(yǎng)48 h。

1.2.3 成熟胚的轉(zhuǎn)接及幼苗移栽 將處理后的成熟胚轉(zhuǎn)接到不含除草劑的MS 培養(yǎng)基中。暗培養(yǎng)5 d后再光照培養(yǎng)，12 h 光照，12 h 黑暗。培養(yǎng)10 d 后，移入田間煉苗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度除草劑對玉米單倍體成熟胚加倍效果的影響

由表1 可知，除草劑濃度不同對玉米單倍體成熟胚加倍效果不同，玉米單倍體加倍率差異顯著。其中，甲基胺草磷溶液（1～20 μmol/L）處理后，加倍率為10.80%～85.16%；炔苯酰草胺溶液（1～20 μmol/L）處理后，加倍率為 9.02%～75.83%；氟樂靈溶液（1～20 μmol/L）處理后，加倍率為7.83%～60.13%。所有處理加倍率均高于對照，其中，甲基胺草磷（10 μmol/L）加倍率最高，先玉 335 單倍體平均加倍率為85.16%，中地88 單倍體平均加倍率為80.20%，鄭單958 單倍體平均加倍率為66.30%；炔苯酰草胺（10 μmol/L）加倍率次之，先玉 335 單倍體平均加倍率為75.83%，中地88 單倍體平均加倍率為74.76%，鄭單958 單倍體平均加倍率為60.12%；氟樂靈（5 μmol/L）加倍率最低，先玉 335 單倍體平均加倍率60.13%，中地88 單倍體平均加倍率56.33%，鄭單958 單倍體平均加倍率為45.06%；隨著3 種除草劑濃度的增加，對玉米成熟胚的抑制效果逐漸加大，加倍率先升后降。

2.2 不同基因型單倍體加倍效果分析

從表1 可以看出，先玉335 單倍體的加倍率為15.50%～85.16%，中地88 單倍體的加倍率為13.08%～80.20%，鄭單958 單倍體的加倍率為7.83%～66.30%，所有處理加倍率均高于對照。先玉335、中地 88 和鄭單 958 這 3 個雜交種中，10 μmol/L甲基胺草磷加倍率最高，分別為85.16%、80.20%和66.30%。

從表2 可以看出，10 μmol/L 甲基胺草磷溶液處理不同基因型的玉米單倍體加倍效果有差異，其中，單倍體平均加倍率最好的是先玉335，達(dá)85.16%，中地88 的單倍體次之，為80.20%，鄭單958 的單倍體最低，為66.30%。方差分析表明，先玉335 與鄭單958 的單倍體加倍率、中地88 與鄭單958 的單倍體加倍率均呈顯著差異；先玉335 與鄭單958、中地88 與鄭單958 的單倍體加倍率呈極顯著差異；先玉335 與中地88 的單倍體加倍率無顯著差異。

表1 不同濃度除草劑對玉米單倍體成熟胚加倍效果的方差分析

表2 10 μmol/L 甲基胺草磷對不同基因型單倍體加倍效果的方差分析

3 結(jié)論與討論

玉米單倍體加倍效果除了與加倍藥劑和加倍方法有關(guān)外，還與單倍體材料的基因型有很大關(guān)系。魏俊杰等[10]利用0.5%秋水仙素處理六葉期的玉米生長點(diǎn)，不同基因型材料加倍率為19.74%～20.80%。徐國良等[16]研究了12 份不同種質(zhì)的玉米單倍體材料，其加倍率存在很大差異，加倍率最高為19.19%，最低為5.62%。本研究中，不同基因型玉米單倍體成熟胚加倍效率最高的是10 μmol/L 甲基胺草磷溶液。玉米單倍體加倍效果受基因型限制，基因型不同，加倍效果有差異，這與徐國良等[16]、魏俊杰等[10]人的研究一致。

3 種除草劑（甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈）對玉米單倍體成熟胚的加倍效果明顯，其中，10 μmol/L 甲基胺草磷的加倍率最高，不同基因型玉米單倍體成熟胚的加倍率差異明顯。