蔡文芝，張效林，馮雪瑤，白凈，劉騰飛，汪潔，韓雅玲

·臨床研究·

CCR7基因rs3136685多態(tài)性與中國北方漢族人群冠心病的關(guān)系

蔡文芝，張效林，馮雪瑤，白凈，劉騰飛，汪潔，韓雅玲

目的探討趨化因子CCR7基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs3136685多態(tài)性與中國北方漢族人群冠心病的關(guān)系。方法連續(xù)收集2010年3月－2011年12月沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科住院患者578例，其中病例組(經(jīng)冠狀動脈造影證實(shí)一支或多支血管狹窄50%以上)287例，對照組(冠狀動脈造影正常且沒有其他粥樣硬化證據(jù))291例。冠心病組根據(jù)血管病變支數(shù)分為3個亞組：單只病變組(n=104)，雙支病變組(n=89)和3支病變組(n=94)。提取患者血液白細(xì)胞基因DNA，采用直接測序法測定趨化因子CCR7基因rs3136685單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的基因型，并進(jìn)行基因型和等位基因與冠心病及冠心病病變程度的相關(guān)性分析。結(jié)果CCR7基因rs3136685單核苷酸多態(tài)性共檢測到3種基因型，即GG型、AG型和AA型，在病例組的分布頻率分別為42.9%、45.6%、11.5%，在對照組分別為43.0%、44.3%、12.7%，兩組基因型分布皆符合Hardy-Weinberg平衡定律，3種基因型在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。A等位基因在病例組及對照組的分布頻率分別為34.3%、34.9%，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。亞組分析顯示，CCR7基因rs3136685單核苷酸多態(tài)性的基因型和等位基因頻率在單支病變、雙支病變及3支病變3個亞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論CCR7基因rs3136685單核苷酸多態(tài)性與中國北方漢族人群冠心病的發(fā)病及疾病嚴(yán)重程度可能無相關(guān)關(guān)系。

炎癥趨化因子類；多態(tài)性，單核苷酸；冠狀動脈疾病

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病(coronary artery disease，CAD)的病理基礎(chǔ)，目前被認(rèn)為是動脈壁的一種慢性炎性，其早期階段的特點(diǎn)是血管內(nèi)皮損傷，血小板黏附、聚集以及單核細(xì)胞募集至血管壁[1]。單核細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后分化為巨噬細(xì)胞，并分泌各種炎癥介質(zhì)，吸引更多的單核細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)入AS部位[2-3]，最終引起AS斑塊不穩(wěn)定和破裂，阻斷正常血流，導(dǎo)致心絞痛和心肌梗死的發(fā)生[3]。

目前研究表明，炎癥細(xì)胞向血管壁的募集依賴于趨化因子及其相應(yīng)G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體[4]，單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞向AS斑塊遷移分別由趨化因子受體CCR2/CCR5/CCR6/CX3CR1、CXCR2/ CXCR4和CCR5/CXCR3介導(dǎo)[4]。CCR7是一種趨化因子受體，其配體為CCL19和CCL21，研究發(fā)現(xiàn)CCR7在人類和小鼠的AS斑塊中大量表達(dá)[5]，表明其可能參與AS的發(fā)展，并造成斑塊不穩(wěn)定。CCR7基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs3136685是CCR7基因內(nèi)含子區(qū)的G/A突變，目前尚少見其與CAD相關(guān)關(guān)系的研究報道。本研究旨在觀察CCR7基因rs3136685多態(tài)是否為中國北方漢族人群CAD的遺傳危險因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續(xù)收集2010年3月－2011年12月沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科住院的CAD患者287例(病例組)，其中男176例，女111例，年齡29～70(56.8±6.2)歲；另選291例因胸痛入院但沒有血管疾病、冠脈主支沒有狹窄的患者為對照組，其中男127例，女164例，年齡56.5±7.0歲。所有入選者均為漢族，無血緣關(guān)系，來自于中國東北地區(qū)，在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院接受冠狀動脈造影檢查。CAD診斷標(biāo)準(zhǔn)：冠脈造影證實(shí)左前降支、左回旋支、右冠狀動脈及主要分支中至少一支主要冠脈動脈狹窄達(dá)50%以上。另根據(jù)冠脈造影顯示所累及血管數(shù)將病例組分為單支病變(n=104)、雙支病變(n=89)和3支病變(n=94)3個亞組。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有肝臟、腎臟、甲狀腺、血液系統(tǒng)疾病及腫瘤的患者；存在炎癥、感染或自身免疫系統(tǒng)疾病、1型糖尿病及家族性高脂血癥的患者。

1.2基因組DNA提取及基因型分析 空腹抽取靜脈血5m l，EDTA抗凝，采用血液基因組DN A提取試劑盒(沈陽立信生物科技有限公司)提取DNA。以聚合酶鏈反應(yīng)(po lym erase chain reac tion，PCR)擴(kuò)增rs31366858位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)。采用Gene Runner 5.0設(shè)計引物(正義5'-ATCTCTGGTCCAGGAAGAAG-3'，反義5'-TCTCATTGCTCGAAGGTG-3'，產(chǎn)物大小322bp，上海生物工程有限公司合成)。50μl PCR反應(yīng)體系包括2×TaqMasterM ix 25μl、上下游引物各2μl、基因組DNA 2μl、去離子水19μl。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR熱循環(huán)儀(Bio-Rad，USA)中完成，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4m in；94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s，30個循環(huán)；72℃延伸7m in。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，150V電壓下電泳30m in，凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。SNP檢測：將目的DNA片段送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行焦磷酸測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行分析。以Hardy-Weinberg平衡定律檢測樣本的群體代表性。計數(shù)資料如基因型和等位基因頻率采用基因直接計數(shù)法計算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系分析采用logistic回歸分析。計量資料以±s表示，各組間比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗(yàn)或方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 兩組間年齡及糖尿病、高血壓構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.2rs3136685單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)分布 CCR7基因rs3136685多態(tài)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為322bp。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，上海生工生物工程有限公司對目的片段進(jìn)行焦磷酸測序，結(jié)果顯示CCR7基因rs3136685為AG多態(tài)，存在GG型、AG型及AA型3種基因型(圖1)。

表1 兩組一般資料Tab. 1 Demographic and clinical data of patients involved

圖1 CCR7基因rs3136685單核苷酸多態(tài)測定結(jié)果Fig.1 The polymorphism of CCR7 rs3136685 mononucleotide

2.3rs3136685基因型及等位基因分析 病例組和對照組均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(χ2分別為0.05和0.17，P＞0.05，表2)。兩組基因型分布情況為：病例組GG型123例(42.9%)、AG型例131(45.6%)、AA型33例(11.5%)，對照組GG型125例(43.0%)、AG型129例(44.3%)、AA型37例(12.7%)。兩組各基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.23，P=0.91)；G、A等位基因在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.04，P=0.84)?；蛐秃偷任换蚍植冀?jīng)logistic回歸分析，校正性別和各冠心病危險因素后P值分別為0.87、0.78，差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表2 兩組rs3136685位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab. 2 Hardy-Weinberg equilibrium test of rs3136685 genotype in patients involved

表3 兩組rs3136685位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率Tab.3 Genotype and allele frequency of rs3136685 in patients involved

2.4rs3136685多態(tài)性與冠脈病變程度之間的關(guān)聯(lián)分析 3個亞組中rs3136685基因型的分布情況如下：單支病變組GG型44例(42.3%)、AG型48例(46.2%)、AA型12例(11.7%)；雙支病變組GG型37例(41.6%)、AG型42例(47.2%)、AA型10例(11.2%)；三支病變組GG型42例(44.7%)、AG型41例(43.6%)、AA型11例(11.7%)。A等位基因在3組間的分布分別為72例(35%)、62例(34.8%)、63例(33.5%)。3組各基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.30，P=0.99)，G、A等位基因分布差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.11，P=0.95，表4)。3組間基因型和等位基因兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

AS是一種慢性炎性疾病，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能有關(guān)[2,6]。CCR7是被認(rèn)為是一種重要的維護(hù)機(jī)體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的趨化因子受體，可激活T細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DCs)，并能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞向淋巴結(jié)的歸巢[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，CCR7及其配體CCL19和CCL21均在AS斑塊中高表達(dá)[5]，CCR7基因敲除后小鼠AS斑塊形成明顯減緩[9]，表明CCR7在AS發(fā)展中是一個至關(guān)重要的因素。

CAD已經(jīng)被證實(shí)是一種遺傳及環(huán)境等多種因素共同作用的多基因遺傳性疾病[10-11]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因多態(tài)性在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用已成為研究熱點(diǎn)[12]。CCR7基因定位于17號染色體q12-q21.2，全長為11 702bp，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，編碼378個氨基酸。HapMap中國人群數(shù)據(jù)庫已完成Ⅱ期，其最小等位基因頻率(m inor allele frequency，MAF)已達(dá)到5%水平，足夠進(jìn)行基于“常見疾病-常見變異”的復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián)研究。在CCR7基因及基因兩側(cè)各2.0kb的區(qū)域，以r2=0.8、MAF＞0.05進(jìn)行配置，共選擇出4個標(biāo)簽SNP，均位于內(nèi)含子區(qū)。內(nèi)含子為基因的非編碼區(qū)，越來越多的證據(jù)表明真核生物內(nèi)含子具有一定的生物學(xué)功能[13]，內(nèi)含子區(qū)的基因變異會影響基因拼接[14]并可導(dǎo)致疾病的發(fā)生[15]。本研究選擇CCR7基因rs3136685 SNP進(jìn)行與CAD及CAD病變程度的關(guān)聯(lián)分析，旨在早期預(yù)測CAD及其病變程度，同時為個體化合理用藥、減少各種不良心血管事件的發(fā)生提供更多的臨床依據(jù)。

表4 rs3136685多態(tài)性與冠脈病變程度之間的關(guān)聯(lián)分析Tab. 4 Association analysis between rs3136685 genotype polymorphism and the angiographic severity of CAD

在本研究中GG、GA、AA三種基因型均存在，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)提示來自同一孟德爾群體，人群選擇無偏倚，這消除了因人群偏倚產(chǎn)生的假陽性或假陰性結(jié)果。結(jié)果顯示，兩組人群rs3136685多態(tài)位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)logistic回歸分析校正性別及各冠心病危險因素后亦未發(fā)現(xiàn)rs3136685多態(tài)與CAD和CAD病變程度存在相關(guān)關(guān)系。這可能是因?yàn)閞s3136685多態(tài)位于CCR7的內(nèi)含子區(qū)，不影響CCR7蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯，且不影響基因拼接，故而對CAD的發(fā)病無影響。本研究僅入選了287例CAD患者和291例對照進(jìn)行單核甘酸多態(tài)性分析，樣本量較小，也不能排除因此產(chǎn)生的假陰性結(jié)果，因而需要更大樣本量的病例-對照研究。進(jìn)一步的工作應(yīng)該繼續(xù)篩選CCR7啟動子區(qū)、外顯子區(qū)及3'UTR區(qū)的標(biāo)簽SNP，采用更大樣本量及復(fù)制實(shí)驗(yàn)更加深入地研究CCR7基因多態(tài)性與冠心病及其病變程度之間的關(guān)系。

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Relation ship between CCR7 rs3136685 polymorphism and coronary arteryd isease in Han population in north China

CAI Wen-zhi1, ZHANG Xiao-lin2, FENG Xue-yao2, BAI Jing2, LIU Teng-fei1, WANG Jie2, HAN Ya-ling2*
1Post-graduate School of Liaoning Medical College, Jinzhou, Liaoning 121000, China
2Department of Cardiovascular Disease, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110840, China
*

, E-mail: yalinghan1120@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81100135), and the Major High-teach Clinical ArmyProjects (2010GXJS001)

ObjectiveTo explore the relationship between the polymorphism of CCR7 rs3136685 and the coronary artery disease (CAD) in Han population in north China.MethodsA total of 578 cases (including 287 patients with CAD and 291 control individuals) adm itted to General Hospital of Shenyang military Command from Mar. 2010 to Dec. 2011 were enrolled in the present study. All the subjects were unrelated individuals of Chinese Han inhabited in the northeast area of China, and had undergone coronary angiography. Those with 50% or more angiostenosis in one or more coronary arteries were sorted out as CAD group, which were then divided in 3 subgroups: namely angiostenosis in one vessel (n=104), in two vessels (n=89) and in three vessels (n=94). Those with normal angiography and no evidence of atherosclerosis were grouped as controls. Genom ic DNA was extracted from blood leukocytes and polymorphic genotypes were determined by polymerase chain reaction and sequencing analysis. The correlation of rs3136685 genotype and allele frequency to CAD and the angiographic severity of CAD were analyzed. ResultsThree genotypes (GG, AG and AA) were detected in CCR7 rs3136685 genetic locus, their frequencies were 42.9%, 45.6% and 11.5%, respectively, in CAD group; and 43.0%, 44.3% and 12.7%, respectively, in control group (P＞0.05). The distribution of the 3 genotypes in the both groups was coincident with the law of equilibrium. The distribution frequencies of A allele in CAD group and control group were 34.3% and 34.9% respectively, with no significant difference (P＞0.05). Further stratification analysis among the polymorphism of CCR7 rs3136685 and angiographic severity of CAD also yielded negative results (P＞0.05).ConclusionTheCCR7 rs3136685 polymorphism is unlikely to be a major contributor to the pathogenesis of CAD in Han population in north China.

chemokines; polymorphism, single nucleotide; coronary disease

R541.4

A

0577-7402(2013)07-0561-04

2013-02-29

2013-04-26)

(責(zé)任編輯：張小利)

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81100135)；軍隊臨床高新技術(shù)重大項(xiàng)目(2010GXJS001)

蔡文芝，碩士研究生。主要從事冠心病的治療及基礎(chǔ)研究

121000 遼寧錦州 遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院(蔡文芝、劉騰飛)；110840 沈陽 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(張效林、馮雪瑤、白凈、汪潔、韓雅玲)

韓雅玲，E-mail：yalinghan1120@126.com