郝夢甄，胡志和*

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

海參(Stichopus japonicus)又名刺參、沙哩等，棘皮動物門，海參綱，是重要的海洋無脊椎動物，已有5000萬年歷史，種類有1200多種。我國海參主要分布在黃海、渤海海域和廣東、廣西及海南沿海，主要經(jīng)濟(jì)品種分別為刺參和梅花參，其中刺參是我國品質(zhì)最好的海參種類之一[1]。研究已證明，海參體壁中含有海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白、海參腦苷酯、神經(jīng)節(jié)苷酯等多種生物活性物質(zhì)[2]，具有提高免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗衰老等多種生理功效[3-5]。目前海參的傳統(tǒng)加工方法主要是將鮮海參制作成干參或鹽漬參[6]，大量的活性成分在加工過程中遭到破壞，變性和流失，還會產(chǎn)生不利于吸收和健康的毒素[7]。

超高壓技術(shù)(ultra high-pressure，UHP)是一種新型的非熱殺菌技術(shù)，起源于化工領(lǐng)域，超高壓食品處理最大的特點(diǎn)是可以在室溫或較低的溫度下殺滅微生物、鈍化酶，從而避免了由于高溫處理導(dǎo)致食品營養(yǎng)的破壞或流失，以及食品色澤和風(fēng)味的改變[8-11]。

本實(shí)驗(yàn)在之前研究超高壓滅活海參自溶酶的條件基礎(chǔ)上探討了鮮海參，超高壓處理海參及傳統(tǒng)鹽漬海參經(jīng)泡發(fā)后海參三者的功能成分和4℃冷藏期間質(zhì)構(gòu)的差異，并探討了與燙漂海參和超高壓燙漂海參質(zhì)構(gòu)特性的比較，為鮮海參的超高壓加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮海參及鹽漬海參購于煙臺鈺參堂。

L-羥脯氨酸、半胱氨酸、木瓜蛋白酶、EDTA 美國Sigma公司；甲醇(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；PMP衍生試劑(稱取PMP0.871g，溶于10mL無水甲醇)；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L3-600/0.6超高壓生物處理機(jī) 天津市華泰森森生物工程技術(shù)有限公司；Sigma 3-18k離心機(jī) 美國Sigma公司；電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UDK159全自動凱式定氮儀測定 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；P/ACE MDQ 型毛細(xì)管電泳儀 美國貝克曼庫爾公司；SK5200H 超聲波清洗機(jī) 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；熔融石英毛細(xì)管(未涂層) 河北永年銳灃色譜器件有限公司；SMSTA.XTPlus質(zhì)構(gòu)儀 北京微訊超技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

鮮海參處理：用剪刀從海參腹部剪開，取出腸后用清水沖洗內(nèi)壁，再用純凈水沖洗2～3遍。高壓處理鮮海參處理：600MPa、45℃條件下處理35min。燙漂海參處理：80℃燙漂2min。超高壓燙漂海參處理：80℃燙漂2min后，采用HPP.L3-600/0.6超高壓生物處理機(jī)在600MPa、45℃條件下處理35min。

鹽漬海參泡發(fā)處理：干海參洗凈后放入潔凈水中4℃泡發(fā)48h，每天換水1次。泡完后的海參用剪刀將體壁內(nèi)的筋剪斷后放入沸水中煮30～45min，煮完后自然放涼繼續(xù)放入4℃冰箱中泡發(fā)24h。泡完后拿出放入沸水中煮20min，自然放涼放入4℃冰箱泡發(fā)24h后即可。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)特性測定

將處理后樣品分別切成2cm×2cm×2cm的小塊，用SMSTA.XTPlus質(zhì)構(gòu)儀的P50探頭進(jìn)行質(zhì)構(gòu)特性的測試。測試參數(shù)：測試前速率2mm/s，測試速率1mm/s，測試后速率1mm/s，觸發(fā)值5g，距離4mm。海參質(zhì)構(gòu)特性主要以硬度、彈性、黏聚性和咀嚼性為指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。各指標(biāo)的檢測及計(jì)算參考Bourne[12]定義的各質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)的計(jì)算方法。

1.3.3 功能成分含量測定

總蛋白、膠原蛋白和粗多糖含量測定前將鮮海參及不同處理方法的海參冷凍干燥。

1.3.3.1 總蛋白含量測定

參照國標(biāo)GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中第一法——?jiǎng)P氏定氮法，取冷凍干燥后樣品0.5g加入消化液濃硫酸10mL及硫酸銅和硫酸鉀的混合片劑消化后，使用全自動凱式定氮儀測定，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積(mL)。按照公式(1)計(jì)算海參體壁蛋白含量。

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量/%；V1為試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL；V3為吸取消化液濃硫酸的體積/mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度/(mol/mL)，實(shí)驗(yàn)為0.1108mol/mL；m為樣品質(zhì)量/g；F為氮換算為蛋白的系數(shù)，6.25。

1.3.3.2 膠原蛋白含量測定

膠原蛋白在氯化亞錫的鹽酸溶液中水解，釋放出羥脯氨酸，經(jīng)氯胺T氧化，生成含有吡咯環(huán)的氧化物，然后用高氯酸破壞過量的氯胺T。羥脯氨酸氧化物與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的吡咯化合物，在波長560nm處測其吸光度，完成定量[13]。實(shí)驗(yàn)試劑的配制參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取5μg/mL L-羥脯氨酸0、10、20、30、40、50、60、70、80mL于100mL容量瓶中，定容后分別取4mL于20mL具塞試管中，加入2mL氯胺T溶液，搖勻，靜置20min后加入2mL顯色劑，搖勻，60℃保溫20min，冷卻。560nm波長處測定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得擬合方程為：y=4.523x－0.0961(R2=0.9963)，式中，x為吸光度；y為L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度/(μg/mL)。

樣品的消化：向100mL氯化亞錫溶液中加入1g樣品，沸水浴回流6h，過濾至250mL容量瓶，用10mL 6mol/L鹽酸沖洗沉淀，冷卻，定容。吸取5～25mL水解液，調(diào)節(jié)pH值為8.0±0.2，過濾于250mL容量瓶中，用30mL水沖洗沉淀，定容。吸取樣液4mL于20mL具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟進(jìn)行，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)。按公式(2)[14]計(jì)算樣品中膠原蛋白的含量。

式中：X為樣品(海參)中膠原蛋白的含量/%；ρ為從工作曲線中查得的測定液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；m為稱取樣品的質(zhì)量/g；250為干海參消化液的體積/mL；10為消化液稀釋倍數(shù)；13.5為海參中膠原蛋白水解為羥脯氨酸的系數(shù)。

1.3.3.3 粗多糖的提取及含量測定

粗多糖的分離純化[15-16]：樣品于4℃丙酮中浸泡24h，烘干，向1g干物中加入30mL 0.1mol/L乙酸鉀緩沖溶液、100mg木瓜蛋白酶、5mmol/L EDTA和5mmol/L半胱氨酸溶液，60℃水浴反應(yīng)24h，離心去沉淀。上清液中加入2倍體積95%乙醇，4℃過夜，離心。沉淀用95%和無水乙醇洗滌，干燥后溶解，KOH溶液調(diào)pH值至9～10，加1/7體積30% H2O2，50℃反應(yīng)4h，冷卻，離心去沉淀。0℃條件下調(diào)pH2，離心去沉淀。加乙酸鉀至濃度為1.5mol/L，4℃過夜，離心，沉淀用95%和無水乙醇洗滌，60℃干燥。

粗多糖純度測定[17]：多糖純度的測定采用苯酚-硫酸法測定提取的多糖中總多糖含量。原理：多糖在硫酸作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚反應(yīng)顯橙黃色，在490nm波長處有特征吸收。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20mg溶于水，定容至500mL，分別取該葡萄糖溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，加水至2mL，依次加入1mL 6%苯酚和5mL濃硫酸，混勻后靜置20min顯色，490nm波長處測定，獲得擬合方程為：y=0.6855x+0.0138(R2=0.9956)，式中，x為吸光度，y為葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)。按照公式(3)計(jì)算樣品中多糖含量。

式中：ρ1為查標(biāo)準(zhǔn)曲線得葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)；ρ2為粗糖溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；C為鮮海參體壁提取出粗糖含量/%。

1.3.3.4 提取多糖的毛細(xì)管電泳

多糖的衍生化[18]：取海參多糖5mg放入安瓿瓶，加1.5mL 4mol/L的三氟乙酸(TFA)，超聲溶解，110℃水解6h后旋蒸至干，加少量無水甲醇，反復(fù)蒸干3次，加500μL水溶解。取水解液100μL，分別加入120μL 0.5mol/L PMP和100μL 0.3mol/L NaOH溶液，70℃水浴30min。冷卻，加入100μL 0.3mol/L HCl溶液中和。然后加入500μL氯仿渦旋萃取，上層水相反復(fù)萃取3次，即得衍生化樣品。吸取樣品，0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳(HPCE)分析。

電泳條件：毛細(xì)管為未涂層熔融石英管，總長度為60cm，有效長度(從進(jìn)樣端到檢測器)51.5cm，內(nèi)徑50μm。采用壓力自動進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間5s，溫度25℃。運(yùn)行電壓為25kV。檢測波長為214nm。每次進(jìn)樣前用6mol/L硼砂緩沖液沖洗毛細(xì)管3min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海參冷藏期間質(zhì)構(gòu)特性變化

2.1.1 硬度變化

圖 1 不同處理海參4℃冷藏期間硬度變化Fig.1 Change in hardness during cold storage of sea cucumber samples subjected to different treatments

硬度是表現(xiàn)海參肌肉軟硬程度的一項(xiàng)重要性能指標(biāo)，既可理解為是海參肉抵抗彈性變形、塑性變形或破壞的能力，也可表述為抵抗殘余變形和反破壞的能力。由圖1可知，超高壓燙漂海參的初始硬度最大，這可能是由于膠原蛋白的熱變性引起肌纖維收縮，進(jìn)而增加肌肉的硬度，并且肌纖維的收縮程度由膠原間成熟而耐熱的穩(wěn)定性交聯(lián)決定[19-20]。超高壓海參的初始硬度比超高壓燙漂海參小，這由于超高壓處理對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響在一定程度上類似熱處理等其他使蛋白質(zhì)變性的加工方法，400MPa壓力使海參蛋白質(zhì)分子發(fā)生解聚[21]，硬度下降。在后期冷藏期間超高壓海參的硬度均比鮮海參的硬度高，這主要由于超高壓殺滅了海參中微生物并抑制了海參中自溶酶的活性，前期研究發(fā)現(xiàn)在此超高壓處理?xiàng)l件下海參中體壁粗酶酶活僅為處理前的19.28%，從而保持了其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在冷藏28d后超高壓燙漂海參硬度1732.073g仍能保持很好的外觀，而鮮海參從第7天已經(jīng)開始發(fā)生明顯自溶，到第28天時(shí)其硬度僅為505.123g，泡發(fā)鹽漬海參硬度也僅為384.074g，這可能由于其中的微生物和自溶酶的共同作用導(dǎo)致，說明超高壓燙漂能夠延長鮮海參的冷藏時(shí)間。

2.1.2 彈性變化

圖 2 不同處理海參4℃冷藏期間彈性變化Fig.2 Change in springiness during cold storage of sea cucumber samples subjected to different treatments

彈性是反映海參受外力作用時(shí)變形后的恢復(fù)程度。肌肉彈性與肌肉間的結(jié)合力大小有關(guān)，肌肉間的結(jié)合力越大，即海參肉組織破壞程度越小，彈性越大。由圖2可知，燙漂海參的彈性明顯高于鮮海參，這是由于熱加工使海參體積縮小，膠原纖維收縮使海參體內(nèi)大量自由水排出，從而海參的組織結(jié)構(gòu)更加緊致有彈性[22]。隨著貯藏時(shí)間延長，由于海參體內(nèi)微生物的作用以及內(nèi)源酶的分解作用使膠原蛋白被降解，從而鮮海參、泡發(fā)鹽漬海參及燙漂海參的彈性均明顯下降，而超高壓海參在貯藏第28天后彈性為0.598，超高壓燙漂海參的彈性為0.689，避免了此變化的發(fā)生。

2.1.3 黏聚性變化

黏聚性是咀嚼海參肉時(shí)，海參肉抵抗受損并緊密連接使其保持完整的性質(zhì)，同樣反映樣品內(nèi)部黏合力。由圖3可知，不同處理的海參在貯藏期間黏聚性的變化趨勢與硬度及彈性的變化趨勢一致，泡發(fā)鹽漬海參的黏聚性最低且降低幅度最大，貯藏28d后其黏聚性降低了91.6%，這與其在加工過程中與質(zhì)構(gòu)有關(guān)的主要功能成分——膠原蛋白的流失有密切關(guān)系。同樣，超高壓海參和超高壓燙漂海參的黏聚性在4℃冷藏期間降低幅度較小，在貯藏28d后黏聚性分別為0.304和0.344，僅比最初值分別降低了30.11%和33.97%。

圖 3 不同處理海參4℃冷藏期間黏聚性變化Fig.3 Change in cohesiveness during cold storage of sea cucumber samples subjected to different treatments

2.1.4 咀嚼度變化

圖 4 不同處理海參4℃冷藏期間咀嚼度變化Fig.4 Change in chewiness during cold storage of sea cucumber samples subjected to different treatments

咀嚼度是一項(xiàng)質(zhì)地綜合評價(jià)指標(biāo)，摸擬海參肉樣品咀嚼成吞咽時(shí)的穩(wěn)定狀態(tài)所需的能量，即所說的咬勁，是肌肉硬度、肌肉細(xì)胞間凝聚力、肌肉彈性等綜合作用的結(jié)果。由圖4可知，不同處理海參在4℃冷藏期間咀嚼度的變化趨勢與硬度的變化趨勢一致。超高壓燙漂海參其咀嚼度明顯高于其他處理方式的海參，這與超高壓處理及適當(dāng)熱加工使海參膠原纖維的聚集有關(guān)，從而使其硬度增加，咀嚼度也隨之增加。并且在貯藏期間這種特性被很好的保留，說明超高壓燙漂處理能夠改善海參的質(zhì)構(gòu)特征，延長其貨架期。

因此，不同海參在4℃冷藏期間彈性，黏聚性和咀嚼度的變化規(guī)律與各自硬度的變化趨勢一致，由于在海參冷藏過程中海參體壁內(nèi)的水分不斷滲出導(dǎo)致每種處理方式的硬度、彈性均有不同程度的下降。實(shí)驗(yàn)充分說明超高壓燙漂處理能夠延長鮮海參的冷藏。

2.2 不同海參功能成分含量的比較

由表1可知，總蛋白含量這與王哲平等[23]的研究成果接近，其他成分含量的差異與海參養(yǎng)殖區(qū)域及個(gè)體差異有關(guān)。經(jīng)SPSS兩兩比較分析超高壓處理的海參粗多糖含量與鮮海參中粗多糖含量差異不顯著(P=0.182)，超高壓燙漂海參中膠原蛋白、海參多糖能夠得到有效保留，含量分別為48.66%和1.25%，明顯高于泡發(fā)鹽漬海參中兩者的含量。泡發(fā)鹽漬海參粗多糖含量與鮮海參中粗多糖含量差異顯著，說明超高壓燙漂能夠有效保留海參中提高免疫的功能成分海參多糖。

表 1 不同處理海參樣品功能成分含量比較結(jié)果Table 1 Functional components of sea cucumber samples subjected to different treatments

2.3 不同海參多糖的毛細(xì)管電泳分析

2.3.1 最大吸收波長測定結(jié)果

由于提取的是海參中的粗多糖，因此對其衍生后產(chǎn)物的最大吸收波長進(jìn)行測定，最大吸收波長掃描如圖5所示。

圖 5 海參多糖最大吸收波長Fig.5 UV absorption spectrum of crude polysaccharides extracted from sea cucumber

由圖5可知，掃描圖中多糖吸收共出現(xiàn)4個(gè)峰值，分別為199、202、231、243nm，多糖對應(yīng)的吸光度分別為1.91、1.95、0.89、0.96。毛細(xì)管電泳采用波長214nm，此波長與多糖的兩個(gè)最大吸收波長202nm和199nm非常接近，因此結(jié)果可靠。

2.3.2 海參多糖毛細(xì)管電泳

表 2 不同處理海參中單糖成分比較Table 2 Monosaccharide composition of sea cucumber samples subjected to different treatments

單糖成分含量可通過峰面積所占比例來表示，實(shí)驗(yàn)采用高效毛細(xì)管電泳儀自帶分析軟件32Karat7.0分析，3種海參多糖中主要單糖成分含量的比較結(jié)果如表2所示。海參多糖中兩種主要單糖成分1和2的含量所占比例在超高壓燙漂海參(5.54%)中明顯高于鮮海參(4.78%)和泡發(fā)鹽漬海參(4.89%)、鮮海參和超高壓燙漂海參中主要單糖種類均為7種，然而泡發(fā)鹽漬海參中單糖種類顯示為9種，這可能由于鹽漬海參工藝造成的或是其中的雜質(zhì)成分。

3 結(jié) 論

超高壓海參及超高壓燙漂海參在質(zhì)構(gòu)特性明顯優(yōu)于鮮海參和泡發(fā)鹽漬海參，并且在4℃冷藏時(shí)間超過28d，這與超高壓能有效殺滅海參中微生物并且滅活海參自溶酶有關(guān)。然而鮮海參在7d后就有明顯的自溶現(xiàn)象，質(zhì)構(gòu)特性已明顯下降，泡發(fā)鹽漬海參本身質(zhì)構(gòu)特性就比較差，在7d后同樣會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。超高壓燙漂海參的多糖含量與鮮海參沒有差異，總蛋白和膠原蛋白含量及主要的單糖含量也明顯高于泡發(fā)鹽漬海參，說明超高壓燙漂能有效保留海參中的功能成分，并且加工工藝簡單，這為超高壓技術(shù)在即食海參中的加工應(yīng)用提供了參考。

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