李 青，周曉宏

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

食品防腐劑在食品的生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過(guò)程中對(duì)防止食品腐敗、保障食品質(zhì)量具有非常重要的作用。我國(guó)目前食品生產(chǎn)中使用的防腐劑絕大多數(shù)都是人工合成的，然而長(zhǎng)時(shí)間的攝入，可能存在潛在的食品安全隱患；另一方面，濫用非食用物質(zhì)或超量超范圍使用食品防腐劑用于食品防腐的現(xiàn)象還時(shí)有發(fā)生，引起了嚴(yán)重的食品安全事件。解決食品安全問(wèn)題除了制定嚴(yán)格的政策法規(guī)和加強(qiáng)食品安全監(jiān)管之外，開(kāi)發(fā)天然、安全、高效、耐熱的食品防腐劑是解決我國(guó)食品安全的重要舉措。

抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的小分子多肽，多數(shù)具有堿性、帶正電荷、抑菌效率高的特點(diǎn)，是構(gòu)成宿主防御細(xì)菌、真菌等入侵的重要分子屏障[1-2]。1975年Boman等[3]從注射了大腸桿菌的美國(guó)天蠶蛹中分離得到了被命名為天蠶素(cecropins)的抗菌活性肽，同時(shí)還完成了這種抗菌肽的氨基酸序列測(cè)定，自此揭開(kāi)了人們對(duì)抗菌肽研究的序幕。目前大多數(shù)抗菌肽應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，而用于食品防腐劑領(lǐng)域的只有乳酸鏈球菌素和ε-多聚賴氨酸。乳酸鏈菌素存在不耐熱的問(wèn)題，且對(duì)G－菌抑菌效果不佳；多聚賴氨酸不能被胃腸道消化，進(jìn)入腸道可能會(huì)抑制腸道中的正常菌群。前者屬于兩親型陽(yáng)離子抗菌肽，而后者屬于單一陽(yáng)離子抗菌肽。由于兩者均作用于帶負(fù)電荷的細(xì)菌磷脂雙分子層細(xì)胞膜保守結(jié)構(gòu)，因而細(xì)菌很難通過(guò)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生抗性[4-5]。多聚陽(yáng)離子抗菌肽的抑菌作用不依賴于空間三維結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的耐熱性，對(duì)G+菌和G－菌都有較好的抑菌作用，具有廣譜性[6]。單一陽(yáng)離子抗菌肽主要由多聚堿性必需氨基酸賴氨酸和精氨酸以及半必需氨基酸組氨酸組成，如果合成由堿性氨基酸通過(guò)α-氨基連接而成的多肽，則進(jìn)入人體消化道后可被胰蛋白酶解形成必需與半必需氨基酸，還具有營(yíng)養(yǎng)作用。因此，合成由精氨酸、賴氨酸、組氨酸3種堿性氨基酸組成的新型的α-多聚陽(yáng)離子抗菌肽用于食品防腐，將具有耐熱、高效、廣譜、不易耐藥、營(yíng)養(yǎng)、天然和安全的特點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外已有采用基因工程的方法制備兩親型抗菌肽的報(bào)道[7-8]，由于抗菌肽通常帶有陽(yáng)離子正電荷，與帶有陰離子的DNA可能發(fā)生相互作用，具有一定的細(xì)胞毒性，因此通常采用融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)[9-10]。這些相關(guān)報(bào)道主要側(cè)重于基礎(chǔ)研究或制藥技術(shù)開(kāi)發(fā)，沒(méi)有單一的α-多聚陽(yáng)離子抗菌肽食品防腐劑基因工程技術(shù)的研究報(bào)道。由于大腸桿菌不是食品安全菌，所以采用畢赤酵母Pichia pastoris表達(dá)體系對(duì)單一的多聚陽(yáng)離子抗菌肽進(jìn)行表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核的表達(dá)系統(tǒng)，具有乙醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)、調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一[11-12]，一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失，所以外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，操作也較為簡(jiǎn)單。

本研究通過(guò)人工合成多聚陽(yáng)離子肽與多聚陰離子肽融合基因，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，表達(dá)抗菌肽融合肽，并采用胃蛋白酶拆分，使融合肽多聚陽(yáng)離子肽與多聚陰離子肽分離，為生產(chǎn)新型食品生物防腐劑多聚陽(yáng)離子抗菌肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

畢赤酵母GS115菌株 美國(guó)Invitrogen公司；枯草芽孢桿菌，為本實(shí)驗(yàn)室分離自腐敗變質(zhì)肉類。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L；BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、磷酸鹽緩沖液100mmol/L、YNB 13.4g/L、生物素4×10-5g/L、甘油10g/L，pH 6.0；BMMY培養(yǎng)基：5g/L過(guò)濾除菌的甲醇替代BMGY的10g/L甘油。最小葡萄糖(minimum dextrose，MD)平板：YNB 13.4g/L、生物素4×10-5g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉15g/L。培養(yǎng)基的配制方法參考美國(guó)Invitrogen公司的Easyselect Pichia Expression Kit說(shuō)明書(shū)。

1.2 試劑

E. coli DH5α、質(zhì)粒pPIC9基因序列及引物，由美國(guó)Invitrogen公司合成，1kb DNA Marker和 DNA Marker Ⅶ北京莊盟生物基因科技公司；超低分子質(zhì)量蛋白Marker北京索萊寶科技公司；Taq酶 日本TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶SalⅠ 美國(guó)NEB公司；Tricine、山梨醇 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒 百泰克公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 融合肽基因合成

設(shè)計(jì)一段60個(gè)氨基酸殘基的融合肽，N端為酸性氨基酸，C端為堿性氨基酸，中間設(shè)置了胃蛋白酶酶切位點(diǎn)疏水性氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)，增加酸性多肽序列是為了中和堿性多肽序列，以免表達(dá)后產(chǎn)生細(xì)胞毒性。序列如下：EDEDQESEDNDESEEDDDEEDEDDQEDEDFYR RHRRKHRRRKKHRRKKHRRRKHHRKHRR。

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性[13]，設(shè)計(jì)這60個(gè)氨基酸融合肽的基因序列：5’-GAAGAUGAGGACCAGGAGUC CGAAGACAAUGAUGAAUCUGAGGAGGACGAUGACGAAGAAGAUGAAGACGAUCAAGAGGAUGAGGACU UCUACAGAAGGCAUAGACGUAAGCAUCGUAGACG UAAGAAGCAUAGACGUAAGAAACAUAGGAGGCGC AAGCACCACAGAAAGCACAGACGU-3’，其中N端為酸性氨基酸，C端為堿性氨基酸。

對(duì)所需合成的目的基因全序列進(jìn)行分析，檢查基因內(nèi)部有無(wú)特別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列，將序列提交美國(guó)Invitrogen公司合成。

首先根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，分別進(jìn)行單鏈Oligo的設(shè)計(jì)及合成，然后利用PCR將合成的Oligo拼接目的基因片段。PCR產(chǎn)物凝膠電泳，割膠回收約180bp目的條帶。將上一步回收好的片段連接入pMD-18T載體16℃連接1h將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑取平板上的單克隆接種于4mL氨芐LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)；質(zhì)粒抽提后測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體

根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)PCR擴(kuò)增引物，并在序列的5’端添加限制性酶切位點(diǎn)EcoRⅠ(GAATTC)，在序列的3’端添加NotⅠ位點(diǎn)(GCGGCCGC)，為了保證密碼框的正確，加入保護(hù)堿基。引物：P1：5’-CCGGAATTCG AAGATGAGGACCAGGAGTCCG-3’，P2：5’-ATAAGA ATGCGGCCGCACGTCTGTGCTTTCTGTGGTGC-3’。

電泳回收約200bp條帶；用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切回收的目的片段，37℃酶切1h后過(guò)柱回收。用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pPIC9載體37℃酶切2h后電泳回收；連接酶切后片段及載體，16℃連接1h后轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

將含有質(zhì)粒的E. coli DH5α按1%接種到10mL LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL Amp)中，37℃振蕩培養(yǎng)約12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖電泳。測(cè)序驗(yàn)證重組克隆中插入片段的序列信息。

1.3.3 畢赤酵母GS115生長(zhǎng)曲線測(cè)定

挑取GS115單菌落，接種在含有5mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、170r/min振蕩過(guò)夜。取100μL培養(yǎng)物接種至含有100mL YPD培養(yǎng)基的250mL三角搖瓶中，30℃、170r/min培養(yǎng)，每隔2h取樣測(cè)定菌液OD600nm值，繪制畢赤酵母生長(zhǎng)曲線。取不同生長(zhǎng)時(shí)期的酵母細(xì)胞用于下述感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化。

1.3.4 畢赤酵母GS115感受態(tài)制備

取不同生長(zhǎng)時(shí)期的酵母菌液轉(zhuǎn)入50mL離心管，4℃、1500×g離心5min，棄上清；50mL冰預(yù)冷無(wú)菌水重懸，4℃、1500×g離心5min，棄上清；25mL冰預(yù)冷無(wú)菌水重懸，4℃、1500×g離心5min，棄上清；5mL 1mol/L冰預(yù)冷山梨醇重懸，4℃、1500×g離心5min，棄上清；約400～500μL 1mol/L冰預(yù)冷山梨醇重懸，每管80～100μL分裝，感受態(tài)細(xì)胞保存在－20℃冰箱，大約1周內(nèi)可用[14]。

1.3.5 目的基因電擊轉(zhuǎn)化GS115

取10μL經(jīng)SalⅠ單酶切處理的重組質(zhì)粒溶解在5～10μL TE溶液中，與80μL GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入0.2cm冰預(yù)冷電擊杯中，冰浴5min。在1.5kV，電容25μF，5ms，電阻200Ω條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電擊后立刻加入1mL 1mol/L冰預(yù)山梨醇，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入滅菌離心管中。分成200μL等份，涂于MD平板上，30℃倒置培養(yǎng)，直至得到單個(gè)菌落生長(zhǎng)。

1.3.6 菌落PCR篩選陽(yáng)性重組子

當(dāng)平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)，挑取單菌落于無(wú)菌EP管中，加入100mg/mL蝸牛酶50μL，37℃水浴反應(yīng)1h破壁，離心取上清作為模板，用酵母5’AOX和3’AOX通用引物對(duì)各個(gè)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：94℃變性10min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸反應(yīng)2min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)完畢后取10μL上樣電泳。對(duì)于顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，重新培養(yǎng)并保存。

1.3.7 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選出的重組菌株接種于YPD培養(yǎng)基，28℃、170r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。涂布YPD平板活化，28℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取一活化的單菌落接種到250mL BMGY培養(yǎng)基中(初始pH6)，28℃、170r/min搖床培養(yǎng)16～18h，至其OD600nm值在2.0～6.0之間。4℃、9000×g離心10min收集菌體，用無(wú)菌超純水洗滌菌體1～2次。用50mL BMMY重懸菌體，將所得菌液置于250mL擋板瓶中，雙層紗布封口，于28℃、170r/min振蕩培養(yǎng)。每24h向培養(yǎng)基中添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%；同時(shí)補(bǔ)充滅菌超純水，使菌液總體積保持不變。按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為1mL，置于1.5mL EP管中，4℃、9000×g離心2～3min，收集上清，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間節(jié)點(diǎn)取：0、24、48、72、96h。Tricine-SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。凝膠的配制方法、電泳條件和染色方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.3.8 表達(dá)條件的優(yōu)化

初始pH值的優(yōu)化：按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GS115重組菌，采用不同初始pH值(3、4、5、6、7)誘導(dǎo)表達(dá)96h，Tricine-SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化：按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GS115重組菌，每24h添加甲醇分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，Tricine-SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，比較甲醇添加量不同對(duì)表達(dá)水平的影響。

1.3.9 表達(dá)產(chǎn)物的酶解與分離

將表達(dá)得到的500mL發(fā)酵液4℃、4000×g離心10min獲上清液，置于冰浴上，將硫酸銨固體緩慢加入蛋白溶液中，邊加邊攪拌，避免局部硫酸銨飽和度過(guò)高，但攪拌的時(shí)候注意不要攪出氣泡，加硫酸銨至50%，4℃、4000×g離心10min，沉淀用50mL PBS重新溶解，用1mol/L HCl溶液調(diào)整溶液 pH值至2.0。加入終質(zhì)量濃度為2mg/mL的胃蛋白酶，37℃水浴4h，在融合肽中酸性多肽和堿性多肽之間連接的疏水性氨基酸Phe、Tyr之間切開(kāi)，形成酸性多肽和堿性多肽產(chǎn)物，85℃、10min滅酶。將滅酶后的酶解液迅速冷卻，12000×g離心20min去除沉淀的酸性多肽部分，上清液用1mol/L的NaOH調(diào)pH值至6.0，－20℃保存。

1.4 酶解蛋白抑菌作用研究

濾紙用打孔器制作成直徑為4mm的圓形濾紙片，121℃高壓滅菌后干燥備用。將枯草芽孢桿菌在液體LB培養(yǎng)基中37℃、170r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)后，與預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌固體LB培養(yǎng)基在45℃左右按1：100混合均勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌鑷子將分別在酶解蛋白樣品，1g/100mL山梨酸鉀溶液、0.1g/100mL乳酸鏈球菌素溶液中浸泡過(guò)的濾紙片放置于平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。觀察抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9的構(gòu)建

圖 1 重組質(zhì)粒pPIC 9的酶切Fig.1 Restriction enzymes analysis of the recombinant plasmid

由圖1可知，泳道1是重組質(zhì)粒用SalⅠ單酶切后獲得的條帶，大小為8000bp左右，泳道2為直接提取的質(zhì)粒。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，用5’AOX1和3’AOX1作為引物，重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR，1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在600bp處擴(kuò)增出一條帶見(jiàn)圖2(泳道1)。進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)，說(shuō)明基因已經(jīng)連接到了質(zhì)粒載體上。

圖 2 重組質(zhì)粒pPIC9的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of the recombinant plasmid

2.2 GS115生長(zhǎng)曲線

圖 3 畢赤酵母GS115生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of GS115

為了控制電轉(zhuǎn)化的條件，在轉(zhuǎn)化前要先測(cè)定菌株的生長(zhǎng)條件，如圖3所示，在YPD中，30℃、170r/min條件下，GS115在14～20h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)應(yīng)OD600nm值為0.6～6.9。對(duì)數(shù)期的細(xì)胞活力強(qiáng)，制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高。

2.3 GS115不同生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

圖 4 細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of growth stage on transformation efficiency

在1.5kV、電容25μF、5ms、電阻200Ω電轉(zhuǎn)杯0.2cm條件下，分別選用處于不同對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段(OD600nm值為0.6～6.9)的酵母細(xì)胞制備感受態(tài)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。圖4表明，用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的畢赤酵母進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，均有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，但不同的生長(zhǎng)階段對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響很大，采用對(duì)數(shù)中期的酵母細(xì)胞即14h，OD600nm值為1.5時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到18個(gè)轉(zhuǎn)化子。

2.4 GS115陽(yáng)性重組子的篩選

圖 5 重組畢赤酵母陽(yáng)性克隆子的篩選Fig.5 Screening for positive clones of Pichia pastoris

受體菌GS115在組氨酸脫氫酶位點(diǎn)His4有突變，因而不能合成組氨酸，而表達(dá)質(zhì)粒pPIC9有His4基因可與宿主進(jìn)行互補(bǔ)，因此通過(guò)不含組氨酸的培養(yǎng)基(MD)來(lái)選擇His+轉(zhuǎn)化子。以MD上生長(zhǎng)的GS115單菌落為模板，用酵母5’AOX和3’AOX通用引物進(jìn)行PCR鑒定，如圖5所示，1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，泳道1無(wú)擴(kuò)增條帶，陰性克隆(泳道2、5、6)在2200bp處有條帶，與酵母基因組AOX基因大小相符，而陽(yáng)性克隆(泳道3、4)在600bp左右有一擴(kuò)增條帶，與目的基因有關(guān)，說(shuō)明基因已經(jīng)整合到宿主酵母中。

2.5 抗菌肽的表達(dá)鑒定

圖 6 畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGEFig.6 Tricine-SDS-PAGE analysis of peptide expressed in Pichia pastoris

目的融合肽的分子質(zhì)量約為8kD，由于分子小，常規(guī)的SDS-PAGE的分離效果差，而在Tricine-SDSPAGE(16%分離膠，10%夾層膠，4%致密膠)上能得到較好的分離。如圖6所示，泳道1、2、3、4、5分別對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間0、24、48、72、96h。結(jié)果表明，在BMMY培養(yǎng)基中，初始pH值為6，甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.5%的條件下，發(fā)酵后72h開(kāi)始有分子質(zhì)量為8kD的蛋白得到表達(dá)，96h蛋白表達(dá)量較高。而陰性對(duì)照相應(yīng)的位置無(wú)任何條帶。說(shuō)明抗菌肽GS115中得以表達(dá)。細(xì)胞最佳收獲時(shí)間是誘導(dǎo)后96h。

2.6 表達(dá)條件的優(yōu)化

圖 7 不同初始pH值對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of initial pH on peptide expression level

由圖7可知，在BMMY培養(yǎng)基中，初始pH值為6.0，甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.5%的條件下，泳道1、2、3、4、5分別對(duì)應(yīng)初始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，誘導(dǎo)96 h后的表達(dá)結(jié)果。在pH＜7.0時(shí)都有蛋白表達(dá)，pH4.0時(shí)表達(dá)量最高。由圖8可知，泳道1、2、3、4分別對(duì)應(yīng)甲醇添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。在改變甲醇添加量時(shí)，每24h添加終體積分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%的條件下有蛋白表達(dá)。

圖 8 不同甲醇添加量對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.8 Effect of methanol concentration on peptide expression level

2.7 抑菌活性研究

圖 9 不同種類防腐劑的抑菌效果Fig.9 Antibacterial effect of different preservatives

由圖9可知，酶解上清液的抑菌直徑為0.8cm，而1g/100mL的山梨酸鉀抑菌直徑是0.6cm。0.1g/100mL的乳酸鏈球菌素抑菌直徑是1.3cm。說(shuō)明酶解蛋白的抑菌活性介于山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素之間。

3 討 論

畢赤酵母沒(méi)有天然的表達(dá)質(zhì)粒，因此一般外源蛋白基因通過(guò)整合型質(zhì)粒載體整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失。整個(gè)體系較為成熟，容易達(dá)到較高的表達(dá)量，且易于大規(guī)模生產(chǎn)，是基因工程中應(yīng)用較為廣泛的一種表達(dá)系統(tǒng)[16]。目前已經(jīng)已有多種蛋白實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)，如各種抗菌肽、白蛋白、人胰島素、干擾素等[17-18]。表達(dá)載體pPIC9是分泌性質(zhì)粒，在多克隆位點(diǎn)前有α-信號(hào)肽編碼序列，可引導(dǎo)外源蛋白分泌至胞外[19]，有利于蛋白下一步的分離純化。

在使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因時(shí)，電轉(zhuǎn)化是最常見(jiàn)且簡(jiǎn)單易行的方法，但是影響轉(zhuǎn)化率的因素相當(dāng)復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)表明，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的酵母細(xì)胞最適合制作感受態(tài)用于電轉(zhuǎn)化，因?yàn)檫@個(gè)階段的細(xì)胞生長(zhǎng)最為旺盛[19]，雖然在電擊條件下細(xì)胞死亡率較高，但是相對(duì)的存活的細(xì)胞較多，得到的轉(zhuǎn)化子的比例也較高。因此畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化以培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600nm值為1.3～1.5)為宜。

本實(shí)驗(yàn)在人工設(shè)計(jì)和合成一段多聚陽(yáng)離子抗菌肽和多聚陰離子肽融合肽基因的基礎(chǔ)上，以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)，利用AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子成功地表達(dá)了目的蛋白，并在α因子信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到胞外，Tricine-SDS-PAGE電泳分析表明表達(dá)的目的蛋白分子質(zhì)量約為8kD，與理論值極相近。以SalⅠ酶線性化的重組質(zhì)粒pPIC9-PCAP轉(zhuǎn)化GS115酵母細(xì)胞時(shí)，將在AOX1處以同源重組的方式插入酵母基因組中，產(chǎn)生Mut+型酵母重組子，它能在甲醇的誘導(dǎo)下表達(dá)外源蛋白。重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中用甲醇誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)時(shí)，控制甲醇體積分?jǐn)?shù)十分重要。在培養(yǎng)中由于甲醇的消耗和揮發(fā)，若甲醇耗盡或體積分?jǐn)?shù)太低，AOX1啟動(dòng)子不能有效啟動(dòng)，外源基因也就不能得到有效表達(dá)，所以需要人工后續(xù)添加甲醇。但若甲醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒害作用。實(shí)驗(yàn)表明在每24h添加終體積分?jǐn)?shù)為0.5%～1.0%的甲醇時(shí)目的蛋白可以得到較好的表達(dá)。

蛋白酶降解蛋白是酵母表達(dá)系統(tǒng)存在的缺陷，降解不僅能引起目的蛋白的產(chǎn)率下降，降解形成的片段還會(huì)造成分離純化的困難。在發(fā)酵的過(guò)程中，隨著外源蛋白在培養(yǎng)基中的濃度不斷提高，蛋白水解酶濃度也隨著升高。由于畢赤酵母的pH值適應(yīng)范圍比較廣，可以在pH3.0～7.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，而不同的蛋白酶有不同的最佳pH值作用范圍，所以適當(dāng)降低發(fā)酵pH值可以在不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)的情況下降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解，提高外源蛋白的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)中pH4.0時(shí)目的產(chǎn)物表達(dá)量最高可能與此有關(guān)。

表達(dá)得到的多聚陽(yáng)離子抗菌肽抑菌效果與傳統(tǒng)的天然防腐劑Nisin相比不夠理想，可能是由于表達(dá)量偏低，在表達(dá)過(guò)程中融合肽有可能別自身蛋白酶酶解，且胃蛋白酶酶解效率不高，以致多聚陽(yáng)離子抗菌肽可能沒(méi)有很好地與多聚陰離子肽分離，最終多聚陽(yáng)離子抗菌肽有效濃度偏低。

本實(shí)驗(yàn)采用畢赤酵母GS115和載體pPIC9對(duì)其分泌性重組表達(dá)，成功表達(dá)了具有活性的抗菌肽，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的穩(wěn)定性。影響外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的因素很多[20-21]，如宿主菌的性質(zhì)、信號(hào)肽、表達(dá)單元的拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的效率、外源基因的序列、培養(yǎng)基、發(fā)酵參數(shù)等。 因此在對(duì)目的基因進(jìn)行改造合成時(shí)，充分考慮了畢赤酵母的密碼子偏好性，并應(yīng)用GS115的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行了篩選，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。通過(guò)這些措施，使得抗菌肽能夠在重組酵母中得以表達(dá)。這不僅對(duì)抗菌肽的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)、抗菌機(jī)理等研究具有重要意義，也為其開(kāi)發(fā)成新型天然食品防腐劑和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

融合表達(dá)雖可大量產(chǎn)生帶有抗菌肽片段的融合蛋白，但在體外活性分析還需對(duì)融合蛋白進(jìn)行切割、分離、純化，并分析抗菌肽的抑菌活性；另外抗菌肽的表達(dá)量也需要提高。這些工作有待進(jìn)一步完善。

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