江 海，李新生,*，吳三橋，張志健，劉 新，韓 豪，高 玥，彭 浩，胥彥明

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；3.陜西城固酒業(yè)有限公司，陜西 城固 723200)

柑橘是世界第一大水果，世界柑橘常年總產(chǎn)量6000～10000萬(wàn)t。分布于全球140個(gè)國(guó)家和地區(qū)，其中柑橘產(chǎn)量居世界前3位的分別為巴西、美國(guó)、中國(guó)[1-3]。我國(guó)柑橘經(jīng)濟(jì)栽培區(qū)主要集中在北緯20～33°之間，海拔700～1000m以下的亞熱帶、熱帶地區(qū)，年栽培面積133～200萬(wàn)公頃之間，占世界栽培面積的20%，其中長(zhǎng)江上中游柑橘帶、贛南-湘南-桂北柑橘帶、浙南-閩西-粵東柑橘帶為我國(guó)柑橘優(yōu)勢(shì)栽培區(qū)[4]。2007年，我國(guó)柑橘種值面積和產(chǎn)量均居世界首位[5]，主要包括日南1號(hào)、宮川、山下紅、大浦、興津等100多個(gè)品中。其中寬皮橘類(lèi)占80%以上，多集中于11—12月上市。世界柑橘加工率約為40%，主要加工產(chǎn)品年產(chǎn)量大約為1860×104t，分別為柑橘汁、橘瓣罐頭，以及柑橘糖制品果醬、果凍和蜜餞[6-7]。而我國(guó)柑橘的加工率不足10%，鮮食量超過(guò)90%。

隨著柑橘栽培面積的擴(kuò)大，加之品種結(jié)構(gòu)不合理，柑橘上市集中，國(guó)內(nèi)缺乏大型柑橘加工企業(yè)等原因，目前國(guó)內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)常常出現(xiàn)“豐產(chǎn)不豐收”，柑橘滯銷(xiāo)，橘農(nóng)“賣(mài)橘難”等問(wèn)題，嚴(yán)重挫傷了橘農(nóng)種植積極性，在個(gè)別地方甚至出現(xiàn)了橘農(nóng)砍伐果樹(shù)的現(xiàn)象。解決我國(guó)柑橘滯銷(xiāo)問(wèn)題，最可行的辦法就是大力發(fā)展柑橘深加工。

鑒于此，本項(xiàng)目組開(kāi)展了利用柑橘果汁發(fā)酵生產(chǎn)柑橘果酒的生產(chǎn)技術(shù)研究，但是，在柑橘果酒發(fā)酵過(guò)程中，橘子汁發(fā)酵液會(huì)出現(xiàn)極明顯的苦味，這成為了困擾柑橘果酒生產(chǎn)的難題。柑橘發(fā)酵中苦味主要來(lái)自檸檬苦素類(lèi)(limonins)的作用。檸檬苦素是一種三萜類(lèi)的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于柑橘屬植物中，至今已從柑橘屬植物中分離出36種檸檬苦素類(lèi)似物及17種檸檬苦素類(lèi)似物配糖體[8-9]。據(jù)報(bào)道，檸檬苦素在水溶液中的苦味閾值約為1×10-6mol/L。有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素和諾米林酸，如果在柑橘果汁中的含量超過(guò)6mg/L，那么這種柑橘就不適合用于飲食業(yè)[10-13]。

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)對(duì)柑橘果酒發(fā)酵工藝中橘汁發(fā)酵液檸檬苦素進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，分析橘子發(fā)酵加工產(chǎn)品中苦味變化趨勢(shì)，旨為柑橘果酒研制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢中主產(chǎn)柑橘品種宮川，經(jīng)剝皮、榨汁、橘汁調(diào)節(jié)糖度后于發(fā)酵罐中發(fā)酵，取不同發(fā)酵階段和陳釀階段的液體為檢測(cè)材料[14-15]。

乙腈(色譜純) 美國(guó)Burdick and Jackson 公司；娃哈哈純凈水；甲醇(分析純) 天津市登峰化學(xué)試劑廠；檸檬苦素(純度為99.8%) 天津一方科技有限公司。

1.2 材料與儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜、ACQUITY TQD三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TD24-低速臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀器有限公司；AUW220D電子天平(十萬(wàn)分之一)、AUY220電子天平(萬(wàn)分之一) 日本島津公司；SK1200H超聲波清洗機(jī) 無(wú)錫市興邦基業(yè)電子有限公司；BM252C榨汁機(jī) 美的公司；全自動(dòng)生物發(fā)酵罐(7L) 上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50mm×2.5mm，1.9μm)，柱溫40℃，流速0.3mL/min，進(jìn)樣5μL。流動(dòng)相為：乙腈-水(A：B)梯度洗脫，乙腈(A)梯度為0～3min(10%～50%)，3～4min(50%～10%)，4～5min(10%～10%)。

1.3.2 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓3.2kV，錐孔電壓40kV，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度400℃，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氣流量800L/h。離子化模式為電噴霧離子源正離子模式(electrospray ionization，ESI+)，碰撞池電壓30V，碰撞氬氣流速0.14mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)，檸檬苦素母離子m/z 471.1，子離子m/z 425.3、161.1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

用AUW220D電子天平，精密稱(chēng)取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品2.85mg，用10mL乙腈溶解，超純水定容至25.0mL。制得檸檬苦素114mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照母液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mL，用50%乙腈溶液定容于10mL容量瓶。得到含檸檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在儀器設(shè)定的色譜-質(zhì)譜條件下，通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品各5μL，以檸檬苦素母離子m/z 471.1進(jìn)行選擇，m/z 425.3為定性離子，m/z 161.1為定量離子。

1.3.5 定量限實(shí)驗(yàn)

將含檸檬苦素0.57μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)谝合噘|(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析，以RSN=10確定檸檬苦素和諾米林檢測(cè)的定量限。

1.3.6 樣品的制備

取3批橘子汁樣品各5L(總糖70.9g/L，總酸9.26g/L)做平行實(shí)驗(yàn)，調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度到218g/L，引入葡萄酒酵母，21℃條件下在發(fā)酵罐中主發(fā)酵7d，主發(fā)酵結(jié)束后酒精度(V/V)為12.5%～13.5%(20℃)，后導(dǎo)入陶罐中進(jìn)行陳釀。

取主發(fā)酵時(shí)間為0、2、4、5、6、7d的發(fā)酵液和陳釀15、30、60、90、180d和360d的基酒進(jìn)行分析檢測(cè)。

精密量取5.0mL橘汁發(fā)酵液于50.0mL具塞三角燒瓶中，加5.0mL乙腈，稱(chēng)定燒瓶質(zhì)量。超聲處理30min，稱(chēng)量燒瓶質(zhì)量，用乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量。4000r/min離心3min，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素線(xiàn)性的繪制

圖 1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin standard

標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖1，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。檸檬苦素線(xiàn)性回歸方程為：Y=62.7883X+11.245，r=0.99954。該檢測(cè)條件下，檸檬苦素在2.85～114ng之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 定量限確定

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，在液相-質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析得到RSN=10，計(jì)算得檸檬苦素的定量檢測(cè)限為2.8ng/mL。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一橘汁發(fā)酵液，按1.3.6節(jié)方法制備樣品，在色譜-質(zhì)譜條件下平行測(cè)定5次，每次進(jìn)樣5μL，測(cè)定檸檬苦素的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中檸檬苦素的峰面積分別為432.1、448.2、428.5、439.8、437.6，RSD為1.73%(n=5)，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一橘汁發(fā)酵液，在色譜-質(zhì)譜條件下，分別在0.5、1、6、12、24h進(jìn)樣5μL檢測(cè)檸檬苦素的峰面積，分別為428.7、432.2、425.6、411.8、410.6，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，求得RSD為2.36%(n=5)。結(jié)果表明在該方法條件下，檸檬苦素24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已測(cè)定檸檬苦素為12.46mg/L的橘汁發(fā)酵液5.0mL，加入5.7mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.3.6節(jié)方法制備樣品條件平行制備3份，在色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定，計(jì)算檸檬苦素的回收率，結(jié)果如表1所示。

表 1 回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Recovery rate of the UPLC- MS/MS method

2.6 橘子汁發(fā)酵液中檸檬苦素含量

表 2 橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的質(zhì)量濃度Table 2 Limonin concentration in fermented orange juice

圖 2 橘汁發(fā)酵液檸檬苦素色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin in fermented orange juice

橘汁發(fā)酵4d后液體中的檸檬苦素的色譜圖見(jiàn)圖2，平行制備3個(gè)批次的橘子汁發(fā)酵液，按1.3.6節(jié)方法進(jìn)行樣品制備，在設(shè)定的儀器條件下進(jìn)行檢測(cè)。橘汁中的檸檬苦素的含量分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖 3 第1(A)、2(B)、3(C)批橘汁樣品中檸檬苦素變化趨勢(shì)圖Fig.3 Changes of limonin in batch 1 (A), 2 (B) and 3 (C) of fermented orange juice

由表2顯示，橘汁在發(fā)酵過(guò)程中檸檬苦素有一個(gè)上升的過(guò)程，基本在主發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬苦素含量逐漸降低。檸檬苦素的變化趨勢(shì)如圖3所示。

3 討論與結(jié)論

3.1 檸檬苦素含量的測(cè)定可用于控制柑橘及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。已報(bào)道的檢測(cè)方法很多, 主要有Davis法、分光光度法、薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)等[8,16-18]。由于檸檬苦素類(lèi)似物配糖體極性強(qiáng)，在提取液中常與許多雜質(zhì)共存，因而對(duì)其檢測(cè)及純化都很困難，多數(shù)檢測(cè)方法效果不佳。對(duì)于柑橘及其加工產(chǎn)品中低含量的檸檬苦素沒(méi)有辦法進(jìn)行精確定量。本實(shí)驗(yàn)采用的UPLC-MS/MS分析方法能夠準(zhǔn)確的定量分析柑橘產(chǎn)品中的檸檬苦素，檢測(cè)限低、樣品處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，能夠用于柑橘及其相關(guān)產(chǎn)品中檸檬苦素含量的分析，控制相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量。

3.2 通常柑橘鮮食無(wú)苦味，但經(jīng)榨汁、殺菌等加工處理后就表現(xiàn)出苦味。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，柑橘發(fā)酵液有一個(gè)明顯的檸檬苦素上升的過(guò)程，該現(xiàn)象印證了橘汁產(chǎn)品的“延遲苦味”。據(jù)研究，柑橘汁出現(xiàn)“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下，果實(shí)中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸堿[19]。

柑橘加工產(chǎn)品出現(xiàn)延遲苦味是柑橘加工業(yè)中比較重要的問(wèn)題，避免苦味的產(chǎn)生或脫除橘汁中的苦味物質(zhì)是提高柑橘加工產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。現(xiàn)常見(jiàn)的脫苦技術(shù)有吸附法、固化霉脫苦法、生物法、β-環(huán)糊精脫苦法、分離法脫苦等[20-21]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾采用自然沉降法，檢測(cè)苦味物質(zhì)的變化?？辔段镔|(zhì)隨時(shí)間從低到高再逐漸降低，也能達(dá)到脫苦的效果，不過(guò)耗時(shí)較長(zhǎng)，但對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)橘子果酒，長(zhǎng)時(shí)間的保存發(fā)酵液能增加產(chǎn)品的厚重感和產(chǎn)品特有風(fēng)味。

3.3 發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件的控制也是橘汁發(fā)酵液產(chǎn)生苦味的一個(gè)重要原因。但無(wú)論如何控制條件，橘子汁發(fā)酵液中的檸檬苦素都有一個(gè)逐漸上升再到慢慢降低的過(guò)程，橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的這種變化趨勢(shì)，將指導(dǎo)橘子酒的生產(chǎn)。取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液勾兌得到橘子果酒，發(fā)酵時(shí)間短的橘子果酒，苦澀味明顯，消費(fèi)者多不接受。360d(一年)后的發(fā)酵液勾兌的產(chǎn)品香味純正，具橘子特有清香、酒體橙黃、澄清透明、酸甜柔和、無(wú)明顯苦澀感，能為多數(shù)消費(fèi)者接受。采用發(fā)酵保藏時(shí)間一年以上的橘汁發(fā)酵液生產(chǎn)橘子果酒，能獲得品質(zhì)較高的橘子酒。

[1] MORTON C M, GRANT M, BLACKMORE S. Phylogenetic relationships of the Aurantioideae inferred from chloroplast DNA sequence data[J]. American Journal of Batany, 2003, 90(10)： 1463-1469.

[2] 鄧秀新. 國(guó)內(nèi)外柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)與柑桔優(yōu)勢(shì)區(qū)域規(guī)劃[J]. 廣西園藝, 2004, 15(4)： 6-10.

[3] 陳仕俏, 趙文紅, 白衛(wèi)東. 我國(guó)柑桔的發(fā)展現(xiàn)狀與展望[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工： 學(xué)刊, 2008(3)： 21-25.

[4] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京： 科學(xué)出版社, 1997, 43(20)： 178-210.

[5] 單楊. 中國(guó)柑桔工業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)與對(duì)策[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2008, 8(1)： 1-8.

[6] 吳厚玖, 孫志高, 王華. 從國(guó)際柑桔加工業(yè)發(fā)展趨勢(shì)看我國(guó)柑桔加工業(yè)發(fā)展方向[J]. 中國(guó)果業(yè)信息, 2006(2)： 1-4.

[7] WU Houjiu. The situation and outlook of citrus processing industry in china[C]. Beijing： China/FAO Citrus Symposium,14-17 May 2001.

[8] 孫崇德, 陳昆松, 陳青俊, 等. 柑桔果實(shí)中天然檸檬苦素和諾米林的提取、鑒別與檢測(cè)[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2004, 4(1)： 6-11.

[9] 孫崇德, 陳昆松, 戚行江, 等. 柑桔果實(shí)檸檬苦素類(lèi)化合物的研究與應(yīng)用[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2002, 14(5)： 297-302.

[10] RIBEIRO M A, SILVEIRA D, FERREIRA-DIAS S. Selective adsorption of limonin and naringin from orange juice to natural and synthetic adsorbents[J]. European Food Research and Technology, 2002, 215(6)： 462-471.

[11] MILLER E G, GONZALES-SANDERS A P, COUVILLON A M. Inhibition of hamster buccal pouch carcinogenesis by limonin 17-beta-D-glucopyranoside[J]. Nutr Cancer, 1992, 17(1)： 1-7.

[12] WADA K, YAGI M, KURIHARA T, et al. Studies on the constituents of edible and medicinal plants. Ⅲ. Effects of seven limonoids on the sleeping time induced in mice by anesthetics[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo), 1992, 40(11)： 3079-3080.

[13] SERIT M, ISHIDA M, KIM M, et al. Antifeedants from Citrus natsudaidai Hayata againes termite Reticulitermes speratus Kolbe[J]. Agric Biol Chem, 1991, 55(9)： 2381-2385.

[14] 劉新, 李新生, 吳三橋, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化橘汁糯米粉糖化醪液制備工藝[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(2)： 84-89.

[15] 劉新, 李新生, 吳三橋, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化柑橘果渣酶解工藝[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(4)： 86-91.

[16] 田慶國(guó), 丁霄霖. 測(cè)定桔核中檸檬苦素類(lèi)似物的分光光度法[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 1999, 18(5)： 45-46.

[17] 陳靜, 高彥祥, 吳偉莉, 等. 高效液相色譜法測(cè)定柑桔汁中的檸檬苦素和柚皮苷[J]. 色譜, 2006, 24(2)： 157-160.

[18] 劉亮, 戚向陽(yáng), 董緒燕, 等. 高效液相色譜法測(cè)定柑桔中的檸檬苦素類(lèi)似物[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(4)： 130-133.

[19] 孫志高, 黃學(xué)根, 焦必寧, 等. 柑桔果實(shí)主要苦味成分的分布及橙汁脫苦技術(shù)研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(6)： 146-148.

[20] 勵(lì)建榮, 梁新樂(lè), 王向陽(yáng), 等. 柑桔類(lèi)果汁脫苦技術(shù)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2000, 26(1)： 55-58.

[21] 鄭育仁. 柑桔類(lèi)果汁脫苦技術(shù)的研究[J]. 漳州職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003(3)： 110-112.