王 強(qiáng)，趙 欣

(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，重慶 400067)

葡萄，葡萄科(Cucurbitaceae)，葡萄屬(Cucurbita)，是僅次于柑橘之后的世界第二大水果，含有多酚、礦物質(zhì)、維生素等生物活性成分[1-2]，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源。國(guó)內(nèi)外研究表明[3-5]，葡萄提取物對(duì)預(yù)防心血管疾病和抑制腫瘤生長(zhǎng)等具有顯著的療效，葡萄提取物備受人們重視?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究表明葡萄中的活性多糖具有抑菌和抗氧化等功能，多糖研究已成為當(dāng)前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[6-8]。

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)2004年全球葡萄總產(chǎn)量約6500萬(wàn)t，其中約71%用來(lái)釀酒，產(chǎn)生的副產(chǎn)物皮渣等占到總加工量的20%[9-10]。在我國(guó)80%的葡萄用于釀酒，釀酒產(chǎn)生約25%(m/m)的皮渣，其中20%～26%是葡萄籽，因此，利用釀酒皮渣可以增加商品附加值[11-12]。但目前食品行業(yè)對(duì)葡萄籽資源的利用十分有限，若將這些廢棄的葡萄籽作為生產(chǎn)粗多糖的原料，可以提高原料利用率，同時(shí)產(chǎn)生大量的優(yōu)質(zhì)活性多糖。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)曲面法進(jìn)行超聲波提取葡萄籽粗多糖的最佳工藝研究，分析各因素對(duì)提取效果的影響，并對(duì)最終粗多糖的化學(xué)組成、分子質(zhì)量分布和抗氧化活性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于葡萄籽粗多糖的科學(xué)研究、引導(dǎo)葡萄籽產(chǎn)業(yè)發(fā)展、指導(dǎo)消費(fèi)及宣傳具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Dextrans系列標(biāo)樣(T-10、T-40、T-70、T-500)、Sephadex-G150 瑞典Pharmacia公司；VC 成都科龍化工試劑廠；雙蒸水、所用溶液均自行配制；MD44-14型號(hào)透析袋 美國(guó)Union Carbide公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；超聲波 寧波新芝生物科技有限責(zé)任公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；凝膠色譜柱(1.6cm×100cm)、恒流泵、自動(dòng)部分收集器 上海華美化學(xué)儀器廠；冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì) 上海菁海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取葡萄籽粗多糖

1.2.1.1 原料預(yù)處理

原料清洗、去除雜質(zhì)；將葡萄籽干燥置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(65℃)干燥至水分含量8%(烘箱法測(cè)定)；粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩。用95%的乙醇40℃熱處理2次，每次1h，以除去單糖、低聚糖和色素等小分子物質(zhì)的干擾，同時(shí)滅酶活以防止在超聲波提取過(guò)程中粗多糖的降解。抽濾、干燥，即得到預(yù)處理葡萄籽粉原料。

1.2.1.2 超聲波輔助提取葡萄籽粗多糖

預(yù)處理后的葡萄籽粉于設(shè)定條件(蒸餾水與葡萄籽液料比：10：1～50：1(mL/g，下同)；超聲功率：70～110W；溫度：30～70℃；超聲時(shí)間：10～50min)熱水提取2次，離心(3000r/min，10min)后合并上清液，95%乙醇、100%乙醇和丙酮分別處理，4℃放置24h后離心(3000r/min，10min)，溶解，Sevag方法脫蛋白[13]，透析(采用透析袋透析)后真空冷凍干燥，即得葡萄籽粗多糖(GSCPs)；GSCPs得率按式(1)計(jì)算。

1.2.2 單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素固定條件為：液料比20：1、超聲功率80W、超聲溫度40℃、超聲時(shí)間25min。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比、超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間為自變量，GSCPs得率為響應(yīng)值(Y)，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。通過(guò)Design-Expert 7.1.6軟件(STAT-EASE Inc., Minneapolis，USA)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)多元回歸分析方法來(lái)擬合多元二次方程。

1.2.3 GSCPs組成分析

以葡萄糖為標(biāo)樣，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，具體參考方法見(jiàn)文獻(xiàn)[14]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考AOCS Ba 4a-38方法[15]，灰分含量測(cè)定參考AOAC 942.05方法[16]；采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)測(cè)定GSCPs的相對(duì)黏度，GSCPs溶液質(zhì)量濃度為10mg/mL(25℃)[17]。

1.2.4 GSCPs分子質(zhì)量分析

采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定GSCPs分子質(zhì)量。分別將已知分子質(zhì)量(MW)的DextranT-10、DextranT-40、DextranT-70、DextranT-500(相對(duì)分子質(zhì)量分別為1萬(wàn)、4萬(wàn)、7萬(wàn)、50萬(wàn))溶解于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為2mg/mL。上Sephadex G-150凝膠柱(1.6cm×100cm)，以純水洗脫，上樣量1mL，流速24mL/h，自動(dòng)部分收集儀收集洗出液，用苯酚-硫酸法于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)葡聚糖，根據(jù)洗脫體積求得相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以相同的條件將樣品上柱，根據(jù)洗脫體積，求得分子質(zhì)量[18]。

1.2.5 GSCPs清除DPPH自由基的測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法Liu等[19]進(jìn)行，將DPPH溶液1mL(10–4mol/L，95%乙醇)與不同質(zhì)量濃度(0～0.80mg/mL)的樣品和對(duì)照品(VC)溶液3mL混勻后于波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度Ai，同時(shí)，將DPPH溶液1mL與樣品空白3mL混勻后測(cè)定吸光度Ac，將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液3mL與95%乙醇1mL混勻后測(cè)定吸光度Aj，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 提取參數(shù)對(duì)GSCPs提取效果的影響

液料比是影響粗多糖提取效果的一個(gè)重要因素，根據(jù)傳質(zhì)速率理論，主要表現(xiàn)在影響固相體和液相體之間的濃度差。

圖 1 液料比(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、超聲時(shí)間(D)對(duì)GSCPs提取效果的影響Fig.1 Effect of water/raw material ratio (A), ultrasonic power (B), ultrasonic temperatures (C) and ultrasonic times (D) on yield of GSCPs

由圖1A可知，隨著液體比例的增加，GSCPs得率逐漸從0.94%增加到1.82%，當(dāng)液料比超過(guò)40：1時(shí)，GSCPs得率增大不顯著。由圖1B可知，隨著超聲功率的增大，GSCPs得率先增大后降低，當(dāng)超聲功率為100W時(shí)GSCPs得率達(dá)到最大值1.91%，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時(shí)，GSCPs得率降低，其可能原因是在較高的功率條件下，粗多糖發(fā)生降解。由圖1C可知，在超聲溫度30～40℃范圍，GSCPs得率增加不顯著，之后隨著超聲溫度增加，GSCPs得率呈逐漸增大的趨勢(shì)。但當(dāng)超聲溫度超過(guò)60℃時(shí)，GSCPs得率增加不顯著。超聲時(shí)間對(duì)GSCPs得率的影響與超聲溫度較為相似，如圖1D所示。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取粗多糖比傳統(tǒng)水提的效果更好。一方面，原因可能是超聲波輔助處理提高了粗多糖提取的效率；另一方面，超聲波輔助處理破壞了原料細(xì)胞壁組織，促使水溶性多糖與纖維素、蛋白質(zhì)等的連接健斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄远嗵?，加速了多糖的溶出[20-21]。故本研究把液料比35：1～45：1、超聲功率95～105W、超聲溫度55～65℃、超聲時(shí)間35～45min作為響應(yīng)面試驗(yàn)的考察范圍。

2.2 響應(yīng)面提取葡萄籽粗多糖工藝的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以A料液比、B超聲功率、C超聲溫度、D超聲時(shí)間作四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可獲得GSCPs得率(Y)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可建立如下二次回歸方程：

Y=2.22＋0.072A＋0.097B－0.15C－0.025D－0.067AB＋0.077AC－0.17AD－0.13BC－0.075BD＋0.050CD－0.18A2－0.10B2－0.18C2－0.13D2

表1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology

表2 粗多糖得率回歸方程方差分析表Table 2 Analysis of variance of regression equations

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。Y的A、B、C、AC、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均表現(xiàn)出了顯著水平，二次回歸方程整體模型極顯著，并且失擬項(xiàng)不顯著，該回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合。進(jìn)一步對(duì)該回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型Y的決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)R2Adj分別為95.00%和90.00%，均不小于90%，說(shuō)明模型相關(guān)度很好，P＜0.0001，回歸模型極顯著。模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率[19]，表2中，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，因此證明該模型可以充分地解釋響應(yīng)中的變異，模型擬合度良好。

2.2.2 響應(yīng)面分析和優(yōu)化參數(shù)的優(yōu)化與驗(yàn)證

為了考察交互項(xiàng)對(duì)GSCPs得率的影響，在其他因素條件固定為0水平時(shí)，考察交互項(xiàng)對(duì)GSCPs得率的影響，對(duì)模型進(jìn)行降維分析。經(jīng)Design-Expert 7.1.6軟件分析，所得的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。

Design-Expert軟件分析結(jié)果表明，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)編碼值(0.146, 1.000,－0.837,－0.661)，穩(wěn)定點(diǎn)的特征值表明穩(wěn)定點(diǎn)為最大值點(diǎn)，即液料比41：1、超聲功率105W、超聲溫度56℃、超聲時(shí)間37min時(shí)，GSCPs得率達(dá)到最大值(2.37%)。用此最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到GSCPs得率為(2.41±0.11)%，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化GSCPs提取工藝是可行的。

圖 2 粗多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the effects water/raw material ratio (A), ultrasonic power (B), ultrasonic temperatures (C) and ultrasonic times (D) on the yield of crude polysaccharides

2.3 GSCPs化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特性

圖 3 超聲波輔助提取葡萄籽粗多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular size distribution of GSCPs

測(cè)定GSCPs的理化組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSCPs總糖含量為(73.25±3.79)%，其中含有(3.86±0.17)%蛋白質(zhì)和(2.60±0.14)%灰分，GSCPs黏度為(1.51±0.11)Pa·s。

采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定GSCPs分子質(zhì)量，如圖3所示。超聲波輔助提取GSCPs凝膠柱洗脫曲線(xiàn)主要有4個(gè)洗脫峰，且相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍很寬，分別為13.59×104、4.55×104、1.68×104和1.02×104。

2.4 GSCPs清除DPPH自由基活性

自由基是新陳代謝的副產(chǎn)物，在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡失調(diào)的情況下，過(guò)多的自由基和活性氧的產(chǎn)生、反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及有機(jī)體的衰老。因此，探討粗多糖新資源對(duì)自由基的清除作用具有重要意義。DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517nm波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收(呈深紫色)。而當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)，其517nm波長(zhǎng)吸收消失或減弱，通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性。由圖4可知，GSCPs清除DPPH自由基的能力與VC較為接近，揭示了GSCPs具有較高的抗氧化活性。

圖 4 超聲波輔助提取GSCPs清除DPPH自由基能力Fig.4 DPPH free radical scavenging activity of GSCPs

據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3,6,22]，葡萄提取物的生物活性涉及抗氧化、抑菌、預(yù)防心血管疾病及抑制腫瘤生長(zhǎng)等方面。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GSCPs具有較高的清除DPPH自由基的能力?；诖?，與其他合成抗氧化劑相比，GSCPs具有較高的清除自由基能力，可用于開(kāi)發(fā)研制抗衰老的保健食品和輔助藥物。

3 結(jié) 論

葡萄籽是生產(chǎn)葡萄制品時(shí)的副產(chǎn)物，葡萄籽含有大量的膳食纖維和粗多糖等活性成分，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源。為提高葡萄籽粗多糖的提取率，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲波輔助提取技術(shù)優(yōu)化了GSCPs提取工藝參數(shù)，測(cè)定了其理化組成、分子質(zhì)量分布和抗氧化活性。結(jié)果表明，最佳提取GSCPs工藝參數(shù)為蒸餾水與葡萄籽液料比41：1、超聲功率105W、超聲溫度56℃、超聲時(shí)間37min，在此條件下GSCPs得率為2.37%。此外，GSCPs分子質(zhì)量分布較廣，清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)揭示了GSCPs具有較高的抗氧化能力。

[1] JAYAPRAKASHA G K, SINGH R P, SAKARIAH K K. Antioxidant activity of grape seed (Vitis vinifera) extracts on peroxidation models in vitro[J]. Food Chemistry, 2001, 73： 285-290.

[2] BAIL S, STUEBIGER G, KRIST S, et al. Characterisation of various grape seed oils by volatile compounds, triacylglycerol composition, total phenols and antioxidant capacity[J]. Food Chemistry, 2008, 108： 1122-1132.

[3] 梁志強(qiáng), 陳秋宇, 孫向軍. 葡萄籽和皮萃取物對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞遷移的影響[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(1)： 239-243.

[4] 李貞, 高麗萍, 冷洪濤, 等. 葡萄籽原花青素對(duì)順鉑所致人胚腎細(xì)胞毒性的拮抗作用[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(7)： 315-318.

[5] 郭金英, 李松彪, 劉開(kāi)永, 等. 葡萄籽超微粉對(duì)高血脂金黃地鼠血漿NO、ET-1和C反應(yīng)蛋白的影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(9)： 598-600.

[6] 王忠民, 王躍進(jìn), 周鵬. 葡萄多糖抑菌特性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005(1)： 77-79.

[7] CHAMORRO S, VIVEROS A, ALVAREZ I, et al. Changes in polyphenol and polysaccharide content of grape seed extract and grape pomace after enzymatic treatment[J]. Food Chemistry, 2012, 133： 308-314.

[8] PROZIL S O, COSTA E V, EVTUGUIN D V, et al. Structural characterization of polysaccharides isolated from grape stalks of Vitis vinifera L[J]. Carbohydrate Research, 2012, 356： 252-259.

[9] PASSOS C P, YILMAZ S, SILVA C M, et al. Enhancement of grape seed oil extraction using a cell wall degrading enzyme cocktail[J]. Food Chemistry, 2009, 115： 48-53.

[10] CREWS C, HOUGH P, BRERETON P, et al. Quantitation of the main constituents of some authentic sesame seed oils of different origin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54： 6266-6270.

[11] RICE A C. Solid-waste generation and by-product recovery potential from winery residues[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1976, 27(1)： 21-26.

[12] GOMEZ A M, LOPEZ C P. Recovery of grape seed oil by liquid and supercritical carbon dioxide extraction： a comparison with conventional solvent extraction[J]. Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal, 1996, 61： 227-231.

[13] SEVAG M G, LACKMAN D B, SMOLENS J. The isolation of components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form[J]. Journal of Biological Chemistry, 1938, 124： 425.

[14] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28： 350-356.

[15] AOCS Official Method Ba 4a-38. Nitrogen-ammonia-protein modified kjedahl method[S]. FIRESTONE D. Official Methods and Recommended Practices of the AOCS. American Oil Chemists’ Society, Champaign, IL, USA, 1997.

[16] AOAC-942.05. Ash of animal feed[S]. HELRICH K. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 15th ed. AOAC, Arlington, VA, 1990： 70.

[17] QIAO D, HU B, GAN D, et al. Extraction optimized by using response surface methodology, purification and preliminary characterization of polysaccharides from Hyriopsis cumingii[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 76： 422-429.

[18] LU R, YOSHIDA T. Structure and molecular weight of Asian lacquer polysaccharides[J]. Carhydrate Polymers, 2003, 54： 419-424.

[19] LIU L, SUN Y, LAURA T, et al. Determination of polyphenolic content and antioxidant activity of kudingcha made from Ilex kudingcha C.J. Tseng[J]. Food Chemistry, 2009, 112： 35-41.

[20] 陳紅, 張波, 劉秀奇, 等. 超聲波輔助提取水溶性大豆多糖及純化工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(6)： 139-142.

[21] WEI X, CHEN M, XIAO J, et al. Composition and bioactivity of tea flower polysaccharides obtained by different methods[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 79： 418-422.

[22] 王忠民, 程明冬, 王有平. 葡萄多糖的抑菌作用研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7)： 35-38.