高 翔，李國云，王靜鳳，薛長湖，王玉明，李兆杰*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

黑色素(melanin)是一種不溶于水的生物大分子多聚體，它廣泛存在于動植物體內。根據(jù)產生前體不同，黑色素可分為3類：真黑色素、棕黑色素以及神經元黑色素。真黑色素是由酪氨酸氧化而成的兩種吲哚結構的分子，5,6-二羥基吲哚(DHI)及5,6-二羥基-2-吲哚羧酸(DHICA)為其基本結構單元，呈深黑色；棕黑色素以Cys-Dopa(半胱氨酸多巴)為基本結構單元，分子中含有硫，一般顯棕色或紅色；神經元黑色素以多巴胺為前體。

魷魚墨是魷魚加工過程中的廢棄物，其主要化學成分是黑色素和蛋白多糖復合體。魷魚墨黑色素幾乎為純凈的真黑色素[1]，主要由DHI及DHICA組成，僅含5%左右結合蛋白[2]。在堿性H2O2條件下，DHI和DHICA分別被氧化為2,3-二羧酸吡咯(PDCA)和2,3,5-三羧酸吡咯(PTCA)[3-8]。黑色素具有很強的陽離子絡合特性，它主要通過羧基和去質子化羥基等陰離子起作用[9]，能與Fe(Ⅲ)絡合形成黑色素鐵。前期研究發(fā)現(xiàn)魷魚墨黑色素鐵能夠顯著促進IDA大鼠貧血癥狀的恢復[10]，是改善營養(yǎng)型貧血類保健食品的良好原料。目前對魷魚墨黑色素的組成和定量方法已有一些研究報道[1-3,5,8]，但是，已有的定量檢測方法是否適用于魷魚墨黑色素鐵的定量檢測未見研究報道，因此本實驗對魷魚墨黑色素及黑色素鐵的定量檢測進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北太平洋魷魚(Ommastrephes bartrami)墨囊(－20℃儲藏) 中國水產舟山海洋漁業(yè)公司；5-羥基吲哚(DHI)、5-羥基吲哚-2-羧酸(DHICA) 美國Sigma公司；甲醇(色譜純)，甲酸、30% H2O2、無水乙醚、K2CO3、Na2SO3均為分析純，實驗中所用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀(帶紫外檢測器) 美國Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋轉蒸發(fā)器 德國海道爾夫公司；AB135-S型精密電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；AA6800型石墨爐原子分光光度計 日本島津公司；ZMQS50001型Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 魷魚墨黑色素的提取

采用高速離心法，參照文獻[11]。

1.3.2 魷魚墨黑色素鐵的制備

參照文獻[12-13]制備魷魚墨黑色素鐵，原子分光光度法于248.3nm測定黑色素墨鐵中鐵含量為7%(質量分數(shù))。

1.3.3 黑色素氧化降解產物PDCA及PTCA檢測色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；檢測波長：275nm；進樣量：10μL；流速：0.5mL/min；流動相：0.1%甲酸(流動相A),甲醇(流動相B)；梯度洗脫條件：0～15min，流動相A由98%降至60%，流動相B由2%升至40%，保持5min,20～25min,流動相A由60%降至0%，流動相B由40%升至100%。

1.3.4 PDCA及PTCA標準品制備

按文獻[14-15]方法，精確稱取DHI和DHICA各300mg，分別溶于300mL 1mol/L K2CO3溶液中，加入12mL 30%(體積分數(shù))H2O2，沸水浴加熱反應20min后迅速流水冷卻至室溫，加入18mL 10%(質量分數(shù))Na2SO3溶液終止反應后，以6mol/L HCl溶液調至pH1。待溶液冷至室溫后分別用300mL無水乙醚萃取4次，合并有機相，用300mL超純水水洗一次，有機相于40℃旋轉蒸干后用流動相A(0.1%甲酸)復溶，過0.45μm有機濾膜，液相制備。色譜條件：色譜柱為ZORBAX SBC18(4.6mm×150mm，5μm)、檢測波長275nm、進樣量50μL、流速2mL/min；流動相：0.1%甲酸(流動相A)-甲醇(流動相B)(6：4，V/V)等度洗脫。制備液凍干后即得PDCA及PTCA標準品。

1.3.5 PDCA及PTCA標準曲線

分別配制質量濃度為0.5、1、2、5、10、15μg/mL的PDCA標準溶液及質量濃度為1、5、10、20、30、50μg/mL的PTCA標準溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件進樣分析，以PDCA和PTCA吸收峰面積(y)對應質量濃度(x)繪制得到標準曲線。

1.3.6 反應條件確定

1.3.6.1 H2O2用量對PDCA及PTCA得率的影響

精確稱取10mg黑色素8份，加入10mL 1mol/L K2CO3溶液，分別加入0.02、0.08、0.16、0.3、0.6、0.8、1、2mL 30% H2O2，沸水浴加熱反應20min后迅速流水冷卻至室溫，加入1mL 10% Na2SO3溶液終止反應后，以6mol/L HCl溶液調至pH1，待溶液冷至室溫后以8000r/min離心10min，上清液用50mL無水乙醚萃取4次，合并有機相于40℃旋轉蒸干后用流動相A(0.1%甲酸)定容至10mL，過0.45μm有機濾膜后按1.3.3節(jié)色譜條件測定PDCA及PTCA的含量。

1.3.6.2 氧化時間對PDCA及PTCA得率的影響

精確稱取10mg黑色素5份，加入10mL 1mol/L K2CO3溶液，分別加入0.8mL 30% H2O2溶液，沸水浴加熱反應10、15、20、30、40min，其他操作同1.3.6.1節(jié)。

1.3.6.3 黑色素多次降解對PDCA及PTCA得率的影響

精確稱取10mg黑色素3份(1～3號)，加入10mL 1mol/L K2CO3溶液，分別加入0.8mL 30% H2O2溶液，沸水浴加熱反應20min后迅速流水冷卻至室溫，加入1mL 10% Na2SO3溶液終止反應后，以6mol/L HCl溶液調至pH1，待溶液冷至室溫后以8000r/min離心10min，1號上清液用50mL無水乙醚萃取4次，2號對一次反應完所得沉淀繼續(xù)如上反應一次，合并上清液后，50mL無水乙醚萃取4次。3號對一次反應完所得沉淀繼續(xù)如上反應兩次，合并上清液，50mL無水乙醚萃取4次，其他操作同1.3.6.1節(jié)。

1.3.7 黑色素完全降解對應PDCA及PTCA得率的確定

精確稱取10mg黑色素6份，分別加10mL 1mol/L K2CO3溶液，加入0.8mL 30% H2O2溶液，沸水浴加熱反應20min后迅速流水冷卻至室溫，加入1mL 10% Na2SO3溶液終止反應，其他操作同1.3.5.1節(jié)。根據(jù)1.3.4.3節(jié)所得標準曲線計算產物得率，確定黑色素對應產物PDCA及PTCA的得率。

1.3.8 魷魚墨黑色素鐵的定量分析

精確稱取10mg黑色素鐵3份，經1.3.7節(jié)反應條件處理后按1.3.3節(jié)色譜條件測定PDCA及PTCA含量。根據(jù)建立的魷魚黑色素與PDCA及PTCA之間得率，計算從黑色素鐵中檢出的黑色素含量。

1.3.9 魷魚墨黑色素鐵脫鐵后的定量分析

稱取約1g黑色素鐵，以25mL 0.5mol/L HCl溶液洗5次，25mL超純水洗2次，脫去Fe(Ⅲ)。凍干后精確稱取10mg凍干產物3份，經1.3.7節(jié)反應條件處理后按1.3.3節(jié)色譜條件測定PDCA及PTCA含量。根據(jù)建立的魷魚黑色素與PDCA及PTCA之間得率，計算從除鐵后的黑色素鐵中檢出的黑色素含量。

2 結果與分析

2.1 PDCA及PTCA標準品譜圖

圖1a、1b表明，歸一化分析，標準品PDCA及PTCA純度不小于98%。如圖1c所示，標準品PDCA及PTCA在1.3.3節(jié)所示色譜條件下，峰形對稱且分離良好，分離度R大于2。

圖 1 標準品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of individual and mixed standards of PDCA and PTCA

2.2 PDCA及PTCA標準曲線

以峰面積為縱坐標，對應質量濃度為橫坐標，繪制標準品PDCA及PTCA標準曲線?；貧w方程PDCA：y=21.519x＋2.8684，r=0.9996，線性范圍：0.5～15μg/mL；PTCA：y=64.428x－33.808，r=0.9994，線性范圍：1～50μg/mL，在線性范圍內線性良好。

2.3 反應條件確定結果

2.3.1 H2O2用量及氧化時間對PDCA和PTCA得率的影響

如圖2所示，隨30% H2O2溶液用量的增加，PDCA及PTCA得率隨之增加，當30% H2O2溶液用量大于0.8mL時，PDCA及PTCA產率得最大，并保持穩(wěn)定，故確定30% H2O2溶液用量為0.8mL。如圖3所示，氧化反應時間為20min時，PDCA及PTCA產率最大，且相對穩(wěn)定，氧化時間過長，產物量減少，可能由于產物結構遭到破壞，故確定氧化時間為20min。

圖 2 H2O2用量對PDCA和PTCA得率的影響Fig.2 Effect of H2O2 dosage on PDCA and PTCA yield

圖 3 氧化時間對PDCA和PTCA得率的影響Fig.3 Effect of water bath (for oxdiatiion) time on PDCA and PTCA yields

2.3.2 黑色素多次降解對PDCA和PTCA得率的影響

表1 黑色素降解次數(shù)對PDCA及PTCA得率的影響Table 1 Effect of number of degradation cycles of melanin on PDCA and PTCA yields

氧化降解兩次或者3次相對于降解一次，產物PDCA及PTCA得率變化均在10%以內；氧化降解3次相對于降解兩次，產物PDCA及PTCA得率變化微弱，見表1，說明氧化降解一次即可使魷魚黑色素降解完全，故確定黑色素氧化降解次數(shù)為一次。

2.4 黑色素完全降解對應PDCA及PTCA得率

實驗確定黑色素完全降解對應產物PDCA及PTCA的得率分別為1.272μg/mg和9.479μg/mg，見表2。

表2 魷魚墨黑色素氧化降解后產物PDCA及PTCA得率Table 2 PDCA and PTCA yields from squid melanin after oxidative degradation

2.5 魷魚墨黑色素鐵的定量分析

利用本實驗建立的定量黑色素的方法對魷魚墨黑色素鐵進行定量分析，計算黑色素鐵中黑色素含量為40%左右，詳見表3。結果表明，黑色素在螯合鐵元素后其氧化降解過程及氧化產物的類型受到顯著影響。

表3 魷魚墨黑色素鐵定量分析Table 3 Quantitative analysis of squid melanin-Fe (Ⅲ)

2.6 魷魚墨黑色素鐵除鐵后的定量分析

魷魚墨黑色素鐵經鹽酸除鐵后，利用本實驗建立的定量黑色素的方法對黑色素鐵進行定量分析，計算黑色素鐵中黑色素含量升高至75%左右，脫除螯合鐵對黑色素定量結果有大幅提高，詳見表4。結果表明，單純的脫鐵仍然不能實現(xiàn)魷魚墨黑色鐵中黑色素的準確定量，有待進一步研究。

表4 魷魚墨黑色素鐵脫鐵后定量分析Table 4 Quantitative analysis of squid melanin-Fe (Ⅲ) after expelling Fe

3 結 論

本實驗建立基于黑色素的氧化降解產物PDCA和PTCA的魷魚墨黑色素HPLC定量分析方法，最終確定魷魚墨黑色素完全降解對應產物的得率，PDCA為1.272μg/mg，PTCA為9.479μg/mg。利用該法對魷魚墨黑色素鐵的定量結果顯示，黑色素螯合Fe(Ⅲ)后氧化降解產物PDCA及PTCA的量相對于同等量的黑色素明顯減少，僅為40%；對黑色素鐵進行酸洗脫鐵后，氧化降解產物中PDCA及PTCA的量有大幅度上升，但僅相當于同等量的黑色素的75%。黑色素在螯合鐵元素后，其氧化降解過程及氧化產物的類型受到顯著影響，普通的黑色素定量方法不適用于魷魚墨黑色素鐵的定量分析。

[1] PEZZELLA A, ISCHIA M, NAPOLITANO A, et al. An integrated approach to the structure of sepia melanin： evidence for high proportion of degraded 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid units in the pigment backbone[J]. Tetrahedron, 1997, 53(24)： 8281-8283.

[2] YAN L, SIMON J D. Isolation and biophysical studies of natural eumelanins： applications of imaging technologies and ultrafast spectroscopy[J]. Pigment Cell Research, 2003, 16(6)： 606-618.

[3] ITO S, JIMBOW K. Quantitative analysis of eumelanin and pheomelanin in hair and melanomas[J]. Investigative Dermatology, 1983, 80： 268-272.

[4] ITO S. Reexamination of the structure of eumelanin[J]. Biochimica et biophysica acta, 1986, 883(1)： 155-161.

[5] SMIT N, Van NIEUWPOORT F, OUT C, et al. Measurement of eumelanin by detection of PDCA and PTCA after alkaline hydrogen peroxide degradation[J]. Pigment Cell Research, 2001, 14(5)： 409.

[6] NAPOLITANO A, PERZZELLA A, VINCENSI M R, et al. Oxidative degradation of melanins to pyrrole acids： a model study[J]. Tetrahedron, 1995, 51(20)： 5913-5920.

[7] BORGESA C R, ROBERTSB J C, WILKINSA D G, et al. Relationship of melanin degradation products to actual melanin content： application to human hair[J]. Analytical Biochemistry, 2001, 290(1)： 116-125.

[8] 王鑫玉, 孫守榮, 周艷華, 等.黑色素分析指標的研究進展及其應用[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2008, 35(5)： 31-34.

[9] BARBARA B S. On the structure of human hair melanins from an infrared spectroscopy analysis of their interactions with Cu2+ion[J]. Spectrochimica Acta A, 2001, 57(12)： 2525-2533.

[10] 雷敏, 王玉明, 王靜鳳, 等. 魷魚墨黑色素鐵對大鼠缺鐵性貧血的治療作用[J]. 中國醫(yī)藥大學學報, 2007, 38(6)： 539-543.

[11] LIU Y, SIMON J D. The effect of preparation procedures on the morphology of melanin from the ink sac of Sepia officinalis[J]. Pigment Cell Res, 2003, 16(1)： 72-80.

[12] KROL E S, LIEBLER D C. Photoprotective actions of natural of natural and synthetic melanins[J]. Chem Res Tocicol, 1998, 11(12)： 1434-1440.

[13] 陳士國, 薛長湖, 薛勇, 等. 魷魚墨黑色素的自由基清除活性研究[J]. 中國海洋藥物雜志, 2007, 26(1)： 24-27.

[14] ITO S, FUJITA K. Microanalysis of eumelanin and pheomelanin in hair and melanom as chemical degradation and liquid chromatography[J]. Anal Biochem, 1985, 144(2)： 527-536.

[15] ITO S, WAKAMSTU K. Chemical degradation of melanins application to identification of dopa mine-melanin[J]. Pigment Cell Research, 1998, 11(2)： 120-126.