貝亦江，王 揚(yáng)，何 豐，任勝蘭

(1.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，浙江 杭州 310012；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023)

喹乙醇是一種飼料添加劑，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物有明顯的致畸作用，對(duì)人也有潛在致畸形，致突變，致癌作用，因此在世界范圍內(nèi)都被禁止或限制用作飼料添加劑[1]。3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹乙醇主要代謝產(chǎn)物之一，在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，是國(guó)際食品法典委員會(huì)認(rèn)定的標(biāo)示殘留物之一，可作為殘留分析監(jiān)控的目標(biāo)物質(zhì)。

常用M Q C A 的檢測(cè)方法是高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[2-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[8-13]。雖然LC-MS/MS法提高了定性、定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，但是儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本較高，在推廣程度上受到限制。HPLC法在使用上較為方便、快捷，靈敏度能達(dá)到檢測(cè)要求，但是按國(guó)標(biāo)法操作，通過(guò)萃取和反萃取，生物體的蛋白質(zhì)和脂類難以有效去除，造成上機(jī)液的污染，被檢物質(zhì)本身也在此過(guò)程中損失較多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果和儀器本身都不利。

本實(shí)驗(yàn)參考前人的研究，采用與國(guó)標(biāo)法不同的HPLC法對(duì)不同類型水產(chǎn)品(魚(yú)類、甲殼類、爬行類)中MQCA殘留量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)樣品前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，以期提高回收率，得出方法的檢出限和定量限，為獸藥監(jiān)管部門對(duì)喹乙醇流通的監(jiān)管提供參考方法和依據(jù)，也為喹乙醇及其代謝物在生物體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)手段[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MQCA標(biāo)準(zhǔn)品(＞94.0%) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、甲酸(均為色譜純) 美國(guó)Tedia公司；鹽酸(分析純) 杭州化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉(分析純) 溫州潤(rùn)華化工實(shí)業(yè)公司。

MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量MQCA標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相(甲醇-1.0%甲酸溶液(40：60，V/V))溶解，配制成100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光冷藏，有效期12個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取1.00mL MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，4℃避光冷藏，有效期3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動(dòng)相稀釋至1.00mL，配制成0.01、0.05、0.25、0.5、1.0μg/mL系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

提取液：2.0mol/L鹽酸水溶液；淋洗液：0.05mol/L乙酸鈉-甲醇溶液(稱取4.10g乙酸鈉用甲醇稀釋至1.00L)；洗脫液：2%甲酸-乙酸乙酯溶液(量取20.00mL甲酸用乙酸乙酯稀釋至1.00L)。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀(配可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司；Oasis MAX 3cc固相萃取柱 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-1.0%甲酸溶液(40：60，V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30.0℃；進(jìn)樣量20.0μL；檢測(cè)波長(zhǎng)320nm。

1.3.2 樣品制備

取新鮮或冷凍的供試組織，去除脂肪和筋膜，魚(yú)肉、龜鱉肉去皮，蝦、蟹去殼，切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿。

1.3.3 樣品提取

稱取5.00g樣品置于50mL離心管中，加入15mL 2.0mol/L鹽酸溶液，根據(jù)試樣物理性質(zhì)，漩渦混合1～2min?；旌贤戤吅螅糜跉庠『銣卣袷幤髦?0℃恒溫酸解30min，然后8000r/min離心10min。上清液過(guò)濾收集于另一支50mL離心管中。將過(guò)濾完畢的殘?jiān)俅渭尤?0mL 2.0mol/L鹽酸溶液，8000r/min離心5min，上清液過(guò)濾后收集于同一支50mL離心管中。

1.3.4 樣品凈化

固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。待活化液流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速不大于3mL/min。待樣品提取液全部流出后用10mL 0.05mol/L乙酸鈉-甲醇溶液淋洗固相萃取柱。待固相萃取柱中溶液全部流出后，抽真空5min。用10mL含2%甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫。洗脫液收集于15mL玻璃離心管中，40℃氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)尤?mL流動(dòng)相渦旋振蕩2min溶解，過(guò)0.22μm濾膜后待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖如圖1A所示，陰性樣品添加20μg/kg MQCA得到譜圖如圖1B、1C所示。

圖 1 1.0μg/mL喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)品(A)、陰性樣品添加水平20μg/kg(B)和陰性樣品(C)色譜圖Fig.1 Chromatogram of 1.0 μg/mL MQCA standard (A), blank sample spiked with 20 μg/kg MQCA (B) and blank sample (C)

2.2 樣品分析

向不同水產(chǎn)品(魚(yú)類、爬行類和甲殼類)樣品添加3個(gè)水平的MQCA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)水平設(shè)6個(gè)平行，進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。方法的回收率和精密度見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，在3個(gè)加標(biāo)水平下，回收率在71.0%～ 86.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.84%～7.32%之間。

表1 回收率和精密度記錄Table 1 Recovery rate and precision of the method

2.3 喹乙醇代謝物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

對(duì)0.01、0.05、0.2、0.5、1.0μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜分析，按其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。喹乙醇代謝物在質(zhì)量濃度0.01～1.0μg/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=43.972x＋0.0321，r=0.9998。

2.4 檢出限和定量限

在色譜條件下，按試驗(yàn)方法規(guī)定的稱樣量和定容體積進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)檢測(cè)限測(cè)定信噪比應(yīng)大于3，定量限測(cè)定信噪比大于10的原理，計(jì)算檢出限為4.0μg/kg，定量限為12.0μg/kg，與國(guó)標(biāo)方法[2]相符合，完全滿足國(guó)內(nèi)水產(chǎn)品中MQCA的檢測(cè)要求。

2.5 提取方式的優(yōu)化

現(xiàn)階段，水產(chǎn)品喹乙醇代謝物殘留量的檢測(cè)主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5—2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》[2]。該方法雖然較為簡(jiǎn)便，但是對(duì)于樣品的前處理考慮得并不周全。經(jīng)過(guò)實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)有以下缺點(diǎn)：1、在萃取和反萃取的過(guò)程中，試樣容易損失；2、當(dāng)試樣組織密度較小，懸浮或漂浮于提取液中時(shí)，容易堵塞濾膜，造成過(guò)濾的不充分，從而使上機(jī)液不潔凈，非但影響回收率而且會(huì)對(duì)色譜柱造成損害。

張小軍等[4]提出，用鹽酸水解提取MQCA，陰離子固相萃取柱凈化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取過(guò)程中增加一步提取+振蕩＋離心，并將酸解時(shí)間從60min縮短至30min，回收率顯著提高。而過(guò)濾的過(guò)程并不是必須的，因?yàn)檫^(guò)濾會(huì)降低回收率。只有樣品提取液非常不潔凈，有肉眼能分辨的顆粒狀、絮狀懸浮物將引起SPE柱堵塞的時(shí)候，才需要過(guò)濾。增加提取步驟縮短酸解時(shí)間以及是否過(guò)濾引起的回收率變化見(jiàn)表2、3。

由表2可見(jiàn)，增加提取步驟、縮短酸解時(shí)間前后回收率平均提高6.4%。由表3可見(jiàn)，不進(jìn)行過(guò)濾相對(duì)于過(guò)濾，回收率平均提高13.0%。但由于實(shí)際樣品并非像空白樣品般鮮有雜質(zhì)，因此在回收率符合要求的情況下，樣品均要過(guò)濾。

表2 增加提取步驟、縮短酸解時(shí)間前后的回收率變化Table 2 Influence of more complicated extraction procedure and shorted hydrolysis time on the recovery of MQCA

表3 空白樣品過(guò)濾前后的回收率變化Table 3 Influence of filtration on the recovery of MQCA

2.6 凈化方式的優(yōu)化

固相萃取的主要目的是去除上機(jī)液雜質(zhì)并使得上機(jī)液澄清而不使色譜柱受損。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取液通過(guò)SPE柱的速度對(duì)回收率有顯著影響，速度控制在不大于1滴/s。若提取液過(guò)快通過(guò)SPE柱，則介質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的吸附將不充分，造成目標(biāo)化合物的損失，淋洗和洗脫同理。在洗脫的過(guò)程中，注意洗脫液的用量不能太少，10～15mL較為合適(小于10mL洗脫不充分，而大于15mL則要超出玻璃離心管的容積)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)前人關(guān)于水產(chǎn)品中MQCA殘留量的檢測(cè)方法進(jìn)行探討，對(duì)前人的方法加以改進(jìn)，增加了一次酸解提取步驟，減少了酸解時(shí)間；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品不過(guò)濾時(shí)的回收率較過(guò)濾時(shí)差異較大，為水產(chǎn)品MQCA殘留量檢測(cè)的方法提供了建設(shè)性意見(jiàn)。

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第168號(hào) 飼料藥物添加劑使用規(guī)范[S].

[2] 全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). 農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5—2008 水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法[S].

[3] 吳玉杰, 陳冬梅, 陶燕飛, 等. 高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物組織中3-甲基喹喔啉-2-羧酸殘留量[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 25(4)： 427-430.

[4] 張小軍, 鄭斌, 陳雪昌, 等. 高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物組織中喹乙醇標(biāo)示殘留物[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(24)： 289-292.

[5] 殷居易, 倪梅林, 壽成杰, 等. 雞肉中喹乙醇、卡巴多及其代謝物的殘留檢測(cè)[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2006, 40(1)： 11-15.

[6] YAO Yunshan, SHEN Jianzhong, WU Congming. Determination of 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid in porcine liver by high performance liquid chromatography[J]. Chinaahvm, 2011, 38(2)： 187-190.

[7] WU Yujie, YU Huan, WANG Yulian, et al. Development of a highperformance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues[J]. J Chro A, 2007, 1146(1)： 1-7.

[8] 梅光明, 鄭斌, 陳雪昌, 等. 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版, 2010, 29(3)： 254-259.

[9] 林黎, 謝麗琪, 歐陽(yáng)姍, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代謝物的殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(2)： 38-41.

[10] 趙東豪, 黎智廣, 楊金蘭, 等. 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水產(chǎn)品中殘留的喹乙醇代謝物[J]. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(9)： 19-22.

[11] HUTCHINSON M J, YOUNG P B, KENNEDY D G. Confirmation of carbadox and olaquindox metabolites in porcine liver using liquid chromatography-electrospray, tandem mass spectrometry[J]. J Chro B, 2005, 816(25)： 15-20.

[12] ZHANG Xiaojun, ZHENG Bin, ZHANG Hong, et al. Determination of marker residue of olaquindox in fish tissue by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Separation Science, 2011, 34(4)： 469-474.

[13] WANG Xiaoyang, ZHANG Lifang, XUE Feiqun, et al. Detection of methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in fishes by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Veterinary Science in China, 2007, 37(8)： 718-720.

[14] 陳永平, 林黎明, 張素青, 等. 喹乙醇及其主要代謝物在羅非魚(yú)體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(10)： 54-58.

[15] 楊波, 黃玲利, 劉宇, 等. 喹乙醇及代謝物3-甲基喹喔啉-2-羧酸在豬體內(nèi)生理藥動(dòng)學(xué)模型的建立[C]//第九屆全國(guó)藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 武漢： 中國(guó)藥理學(xué)會(huì), 2009： 69-77.