王麗君，羅羽洧,*，解衛(wèi)華，郁志蕓

(1.金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院，江蘇 南京 210038；2.環(huán)保部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042)

蠶豆(Vica faba L.)又名胡豆、佛豆、羅漢豆等，是我國重要的豆類蔬菜之一。蠶豆?fàn)I養(yǎng)豐富，可加工成蠶豆系列食品，深受人們喜愛。其蛋白質(zhì)含量比禾谷類作物小麥、稻米、玉米高2～3倍。蠶豆中含有豐富鐵、鈣、鋅等為人體所必需的礦質(zhì)元素[1]和蔗糖、半乳糖苷、麥芽糖和乳糖等糖類物質(zhì)。蠶豆還含有大量的植酸[2-4]，對(duì)鐵離子有螯合作用，使其中鐵的生物利用率較低[5-6]。植酸是人類抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，是以植物性食品為主食鐵元素缺乏的重要原因。熱處理[7-8]、輻射處理[9-10]、發(fā)芽處理[11]、發(fā)酵處理[12]都有減少植酸含量的作用。

近年來，發(fā)芽蠶豆作為一種營養(yǎng)食品受到人們的關(guān)注[13-14]。發(fā)芽蠶豆由胚根、胚芽、胚軸和子葉等4個(gè)部分組成，主食部分是子葉。但目前對(duì)發(fā)芽蠶豆植酸和鐵在這4個(gè)部位的空間分布及發(fā)芽過程中含量的變化情況沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究蠶豆發(fā)芽過程中，植酸以及鐵在胚根、子葉、胚芽和胚軸中的空間分布及含量的變化，同時(shí)探討蠶豆發(fā)芽過程中鐵離子存在形態(tài)及其分布。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蠶豆品種為啟豆2號(hào)，2010年購于南京市種業(yè)有限公司。

植酸鈉(99.5%)、鐵粉(99.9%)、次氯酸鈉、氫氧化鈉、三氯化鐵、鹽酸羥胺，均為分析純。

JA2003型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；磁力攪拌器 上海司樂儀器廠；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)和樣品處理

選擇大小均勻一致的蠶豆籽粒100g，用0.5%次氯酸鈉消毒25min，再用去離子水沖洗2次。然后放入表面皿中(直徑40cm)以25℃水浸泡24h，然后在25℃條件下發(fā)芽8d，每天上午和下午各換水1次。每24h取樣1次，把蠶豆的胚根、子葉、胚芽和胚軸剝開，放在聚乙烯袋內(nèi)，然后置于－18℃冰箱中待測(cè)。每處理重復(fù)3次。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 植酸含量

分別取5.00g子葉、3.00g胚根、2.00g胚軸和1.00g胚芽，經(jīng)研磨后置于50mL具塞三角瓶中，加0.35mol/L鹽酸40mL，搖勻后于(30±1)℃條件下振蕩2h。植酸提取液在沸水浴中水浴3min，然后4000r/min離心10min，取上清液，用蒸餾水稀釋至50mL。將經(jīng)過預(yù)處理的717型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂濕法填裝于交換柱中，用0.7mol/L NaCl水溶液洗脫，然后用蒸餾水洗脫至洗脫液無氯離子(加入1mol/L硝酸銀-硝酸溶液，與蒸餾水對(duì)照)。取8mL提取液加入1mL、3% NaOH溶液，補(bǔ)加蒸餾水至30mL，混勻后以1.0mL/min的速率流入離子交換柱。然后用15mL蒸餾水和15mL 0.05mol/L NaCl溶液洗滌，控制流速在50～80mL/min，最后用0.7mol/L NaCl洗脫植酸溶液，洗脫液收集于25mL的容量瓶，用蒸餾水定容。取待測(cè)植酸液(植酸含量在0.1～0.5mg之間)6mL，加入三氯化鐵-磺基水楊酸4mL，搖勻，520nm處測(cè)其吸光度，從回歸方程計(jì)算出試液中植酸含量[15]。Y=487.75X－40.735(R2=0.98)，式中：Y為樣品中植酸含量/(mg/100g)，X為樣品的吸光度。

1.3.2 不同價(jià)態(tài)鐵含量測(cè)定

1.3.2.1 總鐵含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5.000g 蠶豆子葉，濕法消化后，加入1.5mL 1.0mol/L鹽酸羥胺，采用鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定總鐵含量[16]。

1.3.2.2 可溶性總鐵含量

準(zhǔn)確稱取5.000g蠶豆子葉，研磨后以去離子水定容至50mL，充分振蕩溶解，浸提2h。4500r/min離心15min，取上清液，加入1.5mL 1.0mol/L鹽酸羥胺，定容至100mL。用鄰菲羅啉光度法測(cè)定其中的鐵含量即為可溶性總鐵含量。總鐵與可溶性鐵含量之差即為不溶性鐵含量[16]。

1.3.2.3 可溶性二價(jià)鐵、三價(jià)鐵含量

另取上清液1份，調(diào)pH值至4.0左右，同時(shí)加入2.5mL 2%的氟化銨(氟離子可掩蔽三價(jià)鐵-鄰菲羅啉絡(luò)合物光還原作用)，定容至100mL。按鄰菲羅啉光度法測(cè)定其中的鐵含量即為可溶性二價(jià)鐵含量?？扇苄钥傝F含量與可溶性二價(jià)鐵含量之差即為可溶性三價(jià)鐵含量[17]。

1.3.3 植酸酶活性測(cè)定

分別稱取5.000g發(fā)芽蠶豆樣品，研磨后放入4個(gè)100mL燒杯中(4個(gè)重復(fù))，加入50mL冷卻的醋酸緩沖液，用磁力攪拌器攪拌60min，然后過濾，定容至100mL，得到植酸酶粗酶液，置于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

取4支已標(biāo)號(hào)的10mL刻度試管，其中1管作空白對(duì)照，其他3管為反應(yīng)管。在4支刻度試管中分別加入3.000mL植酸鈉溶液，置于37℃水浴鍋預(yù)熱5min，然后以相同時(shí)間間隔(間隔為0.5h)依次在反應(yīng)管中加入已預(yù)熱的植酸酶溶液1.000mL，在37℃水浴鍋中溫育1h，按與加入酶液相同順序和時(shí)間間隔加入4.000mL釩鉬酸銨顯色/終止液，空白管加入1.000mL植酸酶溶液，混合搖勻，用分光光度計(jì)在415nm處比色(以空白管作對(duì)照)讀取吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算植酸酶活性[18]。Y=619.04X(R2=0.98)，式中：Y為樣品植酸酶活性/(U/g)，X為樣品吸光度。每分鐘水解釋放1μmol無機(jī)磷為1個(gè)活性單位(U)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，顯著性為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽過程中植酸在蠶豆不同部位中的含量變化

圖 1 胚根中植酸含量的變化Fig.1 Change in phytic acid content in embryonic radicle

由圖1可知，胚根中植酸含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)芽至第4天，胚根中植酸含量達(dá)到147mg/100g(以干物質(zhì)計(jì)，下同)，然后開始下降，發(fā)芽至第8天，植酸含量下降為24mg/100g。

圖 2 子葉中植酸含量的變化Fig.2 Change in phytic acid content in cotyledon

蠶豆中80%以上的植酸存在于子葉中。在發(fā)芽過程中，植酸酶活性被激活[8]，植酸被大量分解。由圖2可知，在發(fā)芽過程中，蠶豆子葉中植酸含量不斷下降。從開始發(fā)芽的843mg/100g降低到發(fā)芽第8天的413mg/100g。植酸被分解后，釋放出大量的磷元素，在種子發(fā)芽過程中對(duì)植物細(xì)胞壁形成起到骨架作用。

圖 3 胚芽中植酸含量的變化Fig.3 Change in phytic acid content in plumula

由圖3可知，胚芽中植酸含量的變化趨勢(shì)與蠶豆子葉中的變化趨勢(shì)基本一致，均隨發(fā)芽時(shí)間延長其含量不斷下降。但是胚芽中植酸含量顯然低于子葉中的含量，最高時(shí)的含量為161mg/100g。

圖 4 胚軸中植酸含量的變化Fig.4 Change in phytic acid content in embryonic axe

由圖4可知，蠶豆在發(fā)芽的前3d內(nèi)胚軸中植酸含量一直在下降，發(fā)芽至第4天，其胚軸中已檢測(cè)不到植酸。蠶豆中80%以上的植酸存在于子葉中，胚芽中植酸的含量低于子葉中的含量，但是高于胚軸中植酸含量。在發(fā)芽過程中這3個(gè)部位中的植酸分解速率以子葉為最快，其次是胚芽，而以胚軸中的植酸分解的速率最慢。

2.2 鐵在發(fā)芽蠶豆不同部位中的分布

圖 5 鐵在發(fā)芽蠶豆不同部位含量的變化Fig.5 Change in iron content in different parts of germinated faba beans

由圖5可知，子葉中，鐵含量從發(fā)芽前的35.7mg/kg降低到發(fā)芽至第8天時(shí)的27.9mg/kg，差異顯著(P＜0.05)。胚軸中鐵含量高于胚根和胚芽中的含量。發(fā)芽至第8天胚軸中鐵含量達(dá)到19.5mg/kg，比發(fā)芽前增加2.7mg/kg，但是差異不顯著；胚根和胚芽中鐵含量分別從1.6、1.5mg/kg增加到7.1、3.6mg/kg，差異顯著(P＜0.05)。與子葉相比，胚根、胚芽和胚軸中鐵含量差異均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。

2.3 發(fā)芽過程中鐵在子葉中的分布及含量變化

2.3.1 發(fā)芽處理對(duì)蠶豆中鐵化學(xué)形態(tài)的影響

發(fā)芽時(shí)間對(duì)蠶豆中總鐵、可溶性總鐵、可溶性二價(jià)鐵及可溶性三價(jià)鐵含量的影響見表1。為了更好地說明發(fā)芽處理對(duì)蠶豆中不同化學(xué)形態(tài)的影響，對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，得到表2。

表1 發(fā)芽處理對(duì)蠶豆子葉不同化學(xué)形態(tài)鐵含量的影響Table 1 Effect of germination on various chemical forms of iron in cotyledon of faba beans

表2 發(fā)芽處理對(duì)蠶豆子葉不同化學(xué)形態(tài)鐵比值的影響Table 2 Effect of germination on various chemical forms of iron in cotyledon of faba beans %

從表2可以看出，在蠶豆發(fā)芽過程中，可溶性總鐵含量在不斷增加，可溶性二價(jià)鐵占可溶性總鐵的比值也在不斷增加。而可溶性三價(jià)鐵含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，可溶性三價(jià)鐵占可溶性總鐵的比值不斷降低。從表1可以看出，蠶豆發(fā)芽至第8天，可溶性總鐵含量達(dá)到864.95μg/100g，是發(fā)芽前的3倍多，表明發(fā)芽處理顯著提高了可溶性總鐵含量，且可溶性總鐵含量占總鐵含量的比例從7.12提高到30.31，增加4倍以上；可溶性二價(jià)鐵含量增加6倍。提示在發(fā)芽過程中可能存在某種機(jī)制將不溶性鐵轉(zhuǎn)化為可溶性鐵。

2.3.2 蠶豆發(fā)芽過程植酸酶活性的變化對(duì)植酸及可溶性總鐵含量的影響

植酸含量高是導(dǎo)致很多植物性食物中鐵溶解性低的主要原因之一[19]。有研究證明，在一些豆類的發(fā)芽過程中，植酸酶的活性增加，導(dǎo)致植酸分解速度加快，使得螯合的金屬離子，比如鐵離子和鋅離子釋放出來，這樣不溶性鐵離子和鋅離子變成可溶性鐵離子和鋅離子[20]。其中植酸酶活性的大小對(duì)所釋放出來的鐵離子和鋅離子含量有較大影響[21]。本研究測(cè)定了蠶豆發(fā)芽過程中植酸酶活性和植酸含量變化情況，并且與蠶豆發(fā)芽過程中可溶性總鐵含量的變化進(jìn)行了對(duì)比(表3)。在蠶豆發(fā)芽過程中，植酸酶活性顯著提高，蠶豆中植酸含量顯著下降，并且植酸下降的趨勢(shì)和可溶性總鐵含量增加的趨勢(shì)吻合。有研究[22-24]表明，植酸含量的降低使其螯合的金屬離子被釋放出來，本研究結(jié)果與報(bào)道的一致。

表3 植酸酶活性對(duì)發(fā)芽蠶豆中植酸及可溶性鐵含量的影響Table 3 Effect of phytase on the amounts of phytic acid and soluble iron in faba beans

3 討 論

發(fā)芽蠶豆的子葉中植酸含量最高，而在胚軸中為最低。發(fā)芽8d后，子葉中植酸含量比發(fā)芽前減少50%左右，表明發(fā)芽有利于蠶豆植酸分解，同時(shí)浸泡也是導(dǎo)致水溶性植酸含量減少的原因，這在很多研究中都有報(bào)道，并有相同結(jié)論[12,25-27]。發(fā)芽有利于蠶豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)的改善。子葉是發(fā)芽蠶豆的主要食用部分，其質(zhì)量占到95%以上，因此最大限度地減少子葉中植酸含量尤其重要。本實(shí)驗(yàn)是在常溫和常壓條件下進(jìn)行的，如果控制發(fā)芽條件，特別是控制發(fā)芽溫度和浸泡液pH值，對(duì)改變植酸酶活性將起到重要作用[18]。因此，提高植酸酶的活性是最大程度降解植酸的關(guān)鍵。

以往的研究主要集中在發(fā)芽過程中活性物質(zhì)和酶的產(chǎn)生和變化情況，如在發(fā)芽過程中γ-氨基丁酸的產(chǎn)生、植酸酶的合成等[28-30]，而對(duì)于礦質(zhì)元素在發(fā)芽過程中變化方面的研究較少。本研究表明蠶豆發(fā)芽過程中，子葉中鐵含量均在不斷減少，在分生組織比較旺盛的胚根和胚芽中含量則不斷增，原因是胚根和胚芽從子葉中獲得一定數(shù)量的鐵供其生長發(fā)育所需。有研究[31]表明，根的形成和發(fā)育與鐵含量的增加有一定的關(guān)系，鐵元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致根形態(tài)發(fā)育不良。胚芽主要由活躍的分生細(xì)胞構(gòu)成，在蠶豆形態(tài)分化中起到關(guān)鍵作用，胚芽中鐵的增加和分生細(xì)胞的形成與其細(xì)胞壁的構(gòu)成密切相關(guān)。胚芽中鐵含量增加來自于子葉，至于鐵是通過何種途徑運(yùn)輸?shù)?，還有待于進(jìn)一步研究。胚根和胚芽位于蠶豆形態(tài)學(xué)的兩端，在發(fā)芽過程中含量都顯著增加，原因是子葉中鐵分別通過形態(tài)學(xué)的上端與下端運(yùn)輸途徑，并且運(yùn)輸效率跟元素的種類和性質(zhì)有關(guān)。

總之，在發(fā)芽蠶豆的不同部位中鐵的空間分布和含量變化有聯(lián)系也有區(qū)別，其中鐵在子葉中含量最高，其次是胚軸，胚根和胚芽中則最低，但是隨發(fā)芽時(shí)間的不斷增加，其含量在不斷增加(P＜0.05)，在子葉中的情況則相反。

蠶豆發(fā)芽過程中可能存在某些機(jī)制促使鐵的化學(xué)價(jià)態(tài)發(fā)生改變，其中有利于人體吸收的可溶性鐵和二價(jià)鐵的比例都顯著增加。因此，通過發(fā)芽處理可提高蠶豆中鐵的生物利用度。發(fā)芽蠶豆中可溶性總鐵及可溶性二價(jià)鐵的比例雖然增加，但是不溶性鐵仍是蠶豆的主要化學(xué)形態(tài)。因此，需要深入研究發(fā)芽蠶豆中鐵化學(xué)形態(tài)改變的機(jī)理，可為提高發(fā)芽蠶豆鐵的生物有效性提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

發(fā)芽是減少蠶豆子葉植酸含量的一種有效方法。在蠶豆發(fā)芽過程中，鐵含量以子葉為最高，其次是胚軸，而胚根和胚芽中最低。蠶豆發(fā)芽過程中可溶性鐵和二價(jià)鐵的比例顯著增加。因此，通過發(fā)芽處理可以提高蠶豆中鐵的生物有效性。

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