楊 漸，陳 理，俞昌喜

（福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，福建 福州350001）

人 胰 島 素 樣 生 長(zhǎng) 因 子－1（Human insulin like growth factor－1，hIGF－1）在生理活動(dòng)中與神經(jīng)細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育、新陳代謝等密切相關(guān)［1，2］，對(duì)許多疾病具有潛在的臨床治療作用［3－5］，因此外源性 hIGF－1產(chǎn)品具有較大的市場(chǎng)需求。利用基因重組技術(shù)制備hIGF－1是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，要實(shí)現(xiàn)重組hIGF－1的大規(guī)模制備，高密度發(fā)酵是不可缺少的工藝步驟。高密度發(fā)酵技術(shù)即高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（High cell density cultivation，HCDC）能夠顯著增大菌體密度、縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率［6］。

要實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度生長(zhǎng)及重組hIGF－1的高效表達(dá)，首先需要合適的、能夠滿(mǎn)足表達(dá)需要的發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)室中常用的培養(yǎng)基如LB、M9、MBL等成分相對(duì)單一，要用于高密度培養(yǎng)還需要對(duì)其組成尤其是碳源、氮源及其比例進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化［7］。作者在此以M9培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)［8，9］優(yōu)化適合于表達(dá)重組hIGF－1大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為后續(xù)的大量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 菌種與培養(yǎng)基

表 達(dá) hIGF－1 的 工 程 菌 E．coli DH5α／pET32a（IGF－1），自行構(gòu)建并保存。

LB培養(yǎng)基（g·L－1）：胰蛋白胨10．0，酵母提取物5．0，NaCl 10．0，pH 值7．0。使用前加入氨芐青霉素至50μg·mL－1。

M9培養(yǎng)基（g·L－1）：NH4Cl 1．0，KH2PO43．0，Na2HPO46．0，葡萄糖4．0，MgSO40．12，pH 值7．0。使用前加入氨芐青霉素至50μg·mL－1。

1．2 方法

1．2．1 工程菌的搖瓶培養(yǎng)

在前期工作［10，11］基礎(chǔ)上，將凍存的工程菌株復(fù)蘇后鋪平板，37℃下培養(yǎng)24h；挑取單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37℃、250r·min－1下振蕩12h后，按1∶100比例轉(zhuǎn)種于發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩8h，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)6h。

1．2．2 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

在M9培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，首先采用單因素實(shí)驗(yàn)研究不同碳源（葡萄糖、甘油、蔗糖、檸檬酸）及不同氮源（胰蛋白胨、牛肉膏、氯化銨）對(duì)工程菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酸的影響；然后以菌體生長(zhǎng)量（OD600）和重組蛋白表達(dá)率的乘積為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)，考察碳氮源配比和5種 無(wú) 機(jī) 鹽 （Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4）對(duì)工程菌生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1．2．3 分析檢測(cè)

1．2．3．1 菌體密度測(cè)定

采用比色法測(cè)定菌體密度：將培養(yǎng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)至光吸收值在0．3～0．7之間，用分光光度計(jì)測(cè)OD600，測(cè)得值與稀釋倍數(shù)的乘積即為所測(cè)的菌體密度OD600值。

1．2．3．2 重組hIGF－1表達(dá)測(cè)定

采用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，將發(fā)酵液離心去上清，用等體積的PBS洗滌并離心去上清2次，所有樣品加入等體積蛋白電泳上樣緩沖溶液，混勻，100℃下加熱3min，離心5min，取上清10μL上樣電泳，考馬斯亮藍(lán)法染色，采用凝膠分析軟件Band－Scan 5．0分析重組hIGF－1蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果與討論

高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化常在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物形成的不同物質(zhì)［12］。不同工程菌菌株或是含有不同目的基因的相同菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是碳氮源配比的需求也不盡相同。

2．1 碳源對(duì)工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響

培養(yǎng)基中的碳源既是構(gòu)成菌體細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的主要元素，又為微生物生命活動(dòng)提供能量，且某些碳源代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸的積累不利于外源蛋白在M9培養(yǎng)基中的表達(dá)［13］。葡萄糖、甘油、蔗糖及檸檬酸等4種碳源對(duì)工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源對(duì)E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長(zhǎng)（a）和產(chǎn)酸（b）的影響Fig．1 Effect of different carbon sources on growth（a）and acid－producing（b）of E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）

由圖1可看出，蔗糖或檸檬酸不利于工程菌生長(zhǎng)，菌體密度OD600都比較低；以甘油為碳源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)較好，且菌體密度OD600與培養(yǎng)基pH值并不隨甘油濃度的變化而有明顯改變；以葡萄糖為碳源時(shí)，隨其濃度的增加，OD600先升后降，在葡萄糖濃度為0．8%時(shí)達(dá)到最高，發(fā)酵液的pH值則明顯下降。

究其原因，一方面，葡萄糖極易被微生物利用而在一定范圍內(nèi)促進(jìn)工程菌生長(zhǎng)；另一方面，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖超過(guò)了細(xì)菌有氧代謝的能力時(shí)，過(guò)量的葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑，產(chǎn)生酸性代謝副產(chǎn)物丙酮酸，抑制了工程菌的生長(zhǎng)［14］，因此，在以葡萄糖作為碳源發(fā)酵時(shí)，其濃度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)。相對(duì)而言，工程菌對(duì)甘油的利用較慢，甘油作為碳源也不易產(chǎn)生酸性代謝副產(chǎn)物［15］，因此，菌體密度OD600與培養(yǎng)基pH值相對(duì)較為穩(wěn)定。綜合考慮，選擇葡萄糖和甘油作為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源。

2．2 氮源對(duì)工程菌生長(zhǎng)的影響

氮源是菌體合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和含氮代謝物的主要原料，可分為無(wú)機(jī)氮源與有機(jī)氮源。無(wú)機(jī)氮源如氯化銨、硫酸銨等作用持續(xù)時(shí)間短，能夠被微生物快速利用，并且通常會(huì)顯著改變培養(yǎng)基的pH值而影響菌體的生長(zhǎng)；胰蛋白胨和酵母粉等有機(jī)氮源主要以大分子蛋白質(zhì)的形式存在，需進(jìn)一步降解成小分子的肽和氨基酸后才被微生物吸收利用，其利用速度較慢［16］。

不同氮源對(duì)工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同氮源對(duì)E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長(zhǎng)的影響Fig．2 Effect of different nitrogen sources on growth of E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）

由圖2可看出，酵母粉和胰蛋白胨均能較好地促進(jìn)工程菌生長(zhǎng)，濃度在6．0%時(shí)OD600均達(dá)到高峰，但隨其濃度進(jìn)一步增大，工程菌生長(zhǎng)受到抑制；牛肉膏對(duì)工程菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用但相對(duì)較弱；低濃度的氯化銨有利于菌體生長(zhǎng)，但隨其濃度增大，OD600顯著下降。綜合考慮，選擇酵母粉和胰蛋白胨作為優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源。

2．3 培養(yǎng)基碳氮源配比的優(yōu)化

在確定了合適的碳源和氮源后，需要進(jìn)一步優(yōu)化碳氮源配比。碳氮源配比偏小，菌體在發(fā)酵早期生長(zhǎng)過(guò)快，造成菌體提前衰老自溶；碳氮源配比偏大，菌體繁殖數(shù)量少、不利于產(chǎn)物的積累，產(chǎn)率下降［17］。因此在確定以葡萄糖、甘油為復(fù)合碳源，以酵母粉、胰蛋白胨為復(fù)合氮源的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平培養(yǎng)基碳氮源配比優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，各實(shí)驗(yàn)組的重組hIGF－1蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖3。

表1 培養(yǎng)基碳氮源配比優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab．1 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of proportion of carbon source and nitrogen source

由表1可知，葡萄糖濃度對(duì)工程菌生長(zhǎng)的影響最大，0．4%的葡萄糖對(duì)工程菌的生長(zhǎng)最為有利，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中存在的另一種碳源甘油減少了工程菌對(duì)葡萄糖的需求；甘油濃度對(duì)工程菌生長(zhǎng)影響不大，高濃度的甘油（3．0%）也不會(huì)抑制工程菌的生長(zhǎng)；3%的酵母粉即適合于工程菌生長(zhǎng)；而6%的胰蛋白胨對(duì)工程菌生長(zhǎng)最為有利，但在3%時(shí)已基本能滿(mǎn)足工程菌需要，增大濃度對(duì)進(jìn)一步促進(jìn)工程菌生長(zhǎng)十分有限（極差值很小）。綜合考慮菌體生長(zhǎng)量、重組蛋白表達(dá)率及發(fā)酵成本，確定最佳碳氮源配比為 A1B2C1D1，即葡萄糖0．4%、甘油1．5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%。

2．4 培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化

培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽既是菌體內(nèi)某些復(fù)雜化合物的重要組成部分，又參與酶活性的調(diào)節(jié)，如Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋、P3＋等離子可以多種形式存在于培養(yǎng)基中。選擇5種無(wú)機(jī)鹽（Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4）進(jìn)行5因素4水平培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，各實(shí)驗(yàn)組的重組hIGF－1蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖4。

圖3 碳氮源配比優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)中的各組重組hIGF－1的表達(dá)Fig．3 Expression of recombinant hIGF－1of each group in the orthogonal experiment for optimization of proportion of carbon source and nitrogen source

由表2可知，對(duì)工程菌生長(zhǎng)影響較大的無(wú)機(jī)鹽主要是磷酸鹽Na2HPO4與KH2PO4，其最佳濃度分別為1．2%與0．6%，其余3種無(wú)機(jī)鹽對(duì)工程菌生長(zhǎng)影響不明顯（極差值較?。?。最適合工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生 長(zhǎng) 的 無(wú) 機(jī) 鹽 組 合 為：Na2HPO41．2%、KH2PO40．6%、NH4Cl 0．1%、NaCl 0．20%、MgSO40．048%。

表2培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab．2 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of inorganic salts

圖4 在無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)中的各組重組hIGF－1的表達(dá)Fig．4 Expression of recombinant hIGF－1of each group in the orthogonal experiment for optimization of inorganic salts

2．5 工程菌在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

經(jīng)培養(yǎng)基碳氮源配比及無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化，可知適合工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長(zhǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基為：葡萄糖0．4%、甘油1．5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%、Na2HPO41．2%、KH2PO40．6%、NH4Cl 0．1%、NaCl 0．20%、MgSO40．048%。工程菌在此優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖5所示。

由圖5可看出，在優(yōu)化培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)菌體密度OD600最高達(dá)7．5，較初始培養(yǎng)基的一般水平有了很大提高。

3 結(jié)論

在M9培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到了適合于工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0．4%、甘油1．5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%、Na2HPO41．2%、KH2PO40．6%、NH4Cl 0．1%、NaCl 0．20%、MgSO40．048%，在此培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)14h，菌體密度OD600達(dá)7．5。當(dāng)然，高密度發(fā)酵影響因素眾多，要進(jìn)一步提高重組hIGF－1的表達(dá)水平并實(shí)現(xiàn)其在工程菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基中的高效表達(dá)，還需要對(duì)培養(yǎng)條件如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)等進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

圖5 E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig．5 Cell growth curve of E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）in the optimal medium

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