★ 王文 胡鵬翼

（1.江西省皮膚病專科醫(yī)院 南昌 330001；2.江西中醫(yī)學院 南昌 330004；3.江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004）

山藥為薯蕷科多年生宿根蔓草植物山藥（拉丁名為Dioscorea opposita Thunb）的塊莖，又名白茹、土薯、大薯、薯藥，具有補脾、益肺、固腎、益精的作用，原名薯蕷，首見于《神農本草經》，列為上品[1]。山藥主產于河南、廣東、廣西等省亦廣泛栽培，以河南焦作市（古懷慶府）所產“懷山藥”最佳?！侗静菥V目》記載其能“益腎氣，健脾胃，止瀉痢，化痰涏，潤皮毛”，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，山藥具有免疫調節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗突變和肝損傷保護等多種生物活性，主治脾虛泄瀉，久痢，虛勞咳嗽，遺精帶下，小便頻數(shù)，消渴，子宮脫垂。具有益氣補脾、滋補作用、能助消化、補虛勞益氣力，并有緩瀉祛痰等作用。山藥多糖是被公認的重要活性成分之一，本文對山藥飲片中多糖進行提取精制，并采用硫酸-苯酚顯色法[2]進行含量測定。山藥中的尿囊素（allantoin）具有生肌作用，被廣泛用于醫(yī)藥、日化、輕工以及生物工程等領域，為山藥主要活性成分之一，與其功效密切相關，在山藥中含量較高，常作為有效成分評價山藥的質量，因此本文也對山藥中尿囊素進行含量測定。

1 儀器、試劑、材料

1.1 儀器

ΜV2550紫外分光光度計（島津）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；BSA223S sartoris分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；KDM型控溫電熱套（鄄城華魯電熱儀器有限公司）；KQ-300E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有公司）；XW-80A旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；B-490 BUCHI旋轉蒸發(fā)儀（廈門精藝興業(yè)有限公司）；Megafuge 1.0R離心機（德國Thermo公司）

1.2 試劑

硫酸（西隴化工股份有限公司）；苯酚（西隴化工股份有限公司）；無水乙醇（上海振興化工一廠）；氯仿（國藥集團化學試劑有限公司）；正丁醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 材料

鐵棍山藥（河南省溫縣康之源懷藥有限公司）；山藥飲片（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號1109008，產地河南）；D-無水葡萄糖標準品（中國藥品生物制品檢定所，110833-200904）；尿囊素標準品（中國藥品生物制品鑒定所，批號為11501-200202）。

2 方法與結果

2.1 山藥多糖的提取[3]

將山藥飲片按重量比為1：9比例加入蒸餾水，熱回流3次，每次2h，合并3次提取液，放冷后過濾，濾液60℃旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮液加入Sevage試劑（V氯仿：V正丁醇=4：1），混合后劇烈振搖20min，然后再4 000r/min離心10min，棄去下層有機相以及中間層凝聚物，收集上清液，重復1次。取已脫蛋白的上清液加入95%乙醇至乙醇濃度為80%，可見大量的白色絮狀沉淀析出，4℃冷藏過夜，收集沉淀，沉淀用丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌多次后，50℃真空干燥即得山藥多糖。

2.2 山藥中尿囊素的提取

精密稱取山藥飲片粉末0.25g置25mL容量瓶中，加入20%甲醇溶解稀釋至刻度，超聲0.5h，0.45μm微孔濾膜過濾即為山藥飲片供試品溶液。

2.3 山藥多糖的含量測定

2.3.1 檢測波長的選擇：取葡萄糖溶液0.4mL，加雙蒸水到2.0mL，再加質量分數(shù)為6%苯酚溶液1.0mL，用渦旋儀器混勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，再渦旋使之均勻，放置5min后，置沸水浴中加熱15min，取出迅速放在冰水中冷卻至室溫；另以雙蒸水2.0mL，加苯酚和濃硫酸，同上操作做為空白對照，在300-750nm波長范圍掃描，結果最大吸收波長為488.7nm，因此選擇489nm作為山藥多糖的含量測定波長。

2.3.2 標準曲線的制備：稱取吸取D-無水葡萄糖標準品9.99mg置于100mL的容量瓶中，加雙蒸水溶解稀釋到刻度，得到濃度為99.9μg/mL溶液。取99.9μg/mL D-葡萄糖標準液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0分置于10mL具塞試管中，各加雙蒸水到2.0mL，再加質量分數(shù)為6%苯酚溶液1.0mL，用渦旋儀器混勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，再渦旋使之均勻，放置5min后，置沸水浴中加熱15min，取出迅速放在冰水中冷卻至室溫；另以雙蒸水2.0mL，加苯酚和濃硫酸，同上操作做為空白對照，在最大吸收波長（489nm）處測定吸光度值，結果由吸光度值（A）對溶液濃度（C）線性回歸，得回歸方程Y=0.0525X+0.0989，r=0.9993，葡萄糖在2.5-12.49μg/mL范圍內呈線性。

2.3.3 回收率的測定 精密量取已知含量的樣品0.5mL，精密加入D-無水葡萄糖標液（99.9μg/mL）各0.20、0.25、0.3mL，加水至2mL，加6%苯酚1mL，渦旋混勻，迅速加濃硫酸5.0mL，渦旋混勻后放置5min，沸水浴15min，迅速放入冷水中，冷卻至室溫，489nm波長處測定吸光度，計算回收率。結果實驗測得平均回收率為98.95%，RSD為3.14%（n=9）。

2.3.4 精密度：取已知含量的樣品溶液連續(xù)測定5次，按吸光度計算RSD為0.15%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗：取樣品按含量測定方法，每隔20min測1次，在2h內溶液穩(wěn)定，RSD為0.55%。

2.3.6 山藥多糖含量測定：精確稱取山藥多糖10mg，置100mL容量瓶中，蒸餾水超聲溶解稀釋至刻度，取2mL于具塞刻度試管中，再加質量分數(shù)為6%苯酚溶液1.0mL，用渦旋儀器混勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，再渦旋使之均勻，放置5min后，置沸水浴中加熱15min，取出迅速放在冰水中冷卻至室溫；另以雙蒸水2.0mL，加苯酚和濃硫酸，同上操作做為空白對照，在最大吸收波長（489nm）處測定吸光度值，計算含量，結果山藥多糖含量為0.61%，RSD為1.05%。

2.4 山藥尿囊素的含量測定

2.4.1 色譜條件[4]：phenomenex Luna C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；流動相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10min，A為5% ～10%）；流速0.5mL/min；檢測波長為224nm；柱溫為30℃，進樣量20μL。2.4.2標準曲線的制備：精密稱取尿囊素對照品5.10mg置25mL容量瓶中，加90%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，濃度為204g/mL，依次量取該溶液0.25、1、2、3、4mL至5mL容量瓶中，90%甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，并以濃度（C）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程A=11.266C-7.7057，r=0.9991，可見尿囊素在10.2-163.2g/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.3 回收率：精密稱取尿囊素對照適量，加到已知含量樣品中，按供試品溶液制備方法制備待測液。精密吸取20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算樣品中的尿囊素的含量，結果回收率的平均值為100.02%，RSD為3.28%（n=6）。

2.4.4 精密度試驗：取已知含量的樣品溶液連續(xù)測定5次，測定峰面積，結果RSD=1.12%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗：在4h內考擦樣品穩(wěn)定性。精密稱取山藥飲片，按供試品制備方法制備待測溶液，精密吸取20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。結果RSD=1.28%，表明溶液在8h內穩(wěn)定。

2.4.6 樣品含量測定：按“2.2”項制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，代入線性方程計算樣品中的尿囊素的含量，結果含量為0.58%，RSD為0.89%。

3 討論

紫外-可見分光光度法是目前測定多糖含量最常用的方法，常用的顯色劑有苯酚，蒽酮-硫酸和3，5-二硝基水楊酸（DNS）。前兩者主要利用多糖在強酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，然后與酚類或者胺類反應縮合，生成有特定吸收波長的有色物質進行測定；DNS法則是利用了多糖的還原性。目前最常用的為苯酚硫酸法，本文建立的硫酸-苯酚法測定山藥多糖含量，具有精密度良好，重現(xiàn)性強、方便快捷的特點，多糖在2.5-12.49μg/mL范圍內線性關系良好，回收率高，能準確快速地進行含量測定。

本文根據(jù)文獻，在經典苯酚硫酸法基礎上，采用體積分數(shù)80%乙醇溶液熱提以除去單糖、低聚糖、甙類及生物堿等干擾成分，Sevage法脫蛋白，獲得比較純凈的山藥多糖，測得飲片中多糖含量為0.61%，提取后的山藥水溶性多糖的進一步純化和生物活性功能尚待進一步研究。

近年來，對山藥藥材尿囊素含量測定方法研究報道較多，其中HPLC法為測定山藥尿囊素含量常用的分析方法，本文建立的HPLC方法，測定山藥中尿囊素的含量，該法精密度高、操作簡便、準確可靠，為山藥的全面質量控制提供了參考。

[1]張紅英，趙現(xiàn)敏，崔保安.山藥多糖研究進展[J].河南中醫(yī)學院學報.2006，21（127）：87.

[2]徐光域，顏軍，郭曉強，等.硫酸-苯酚定糖法的改進與初步應用[J].食品科學，2005（8）：342-345.

[3]孫鋒，谷文英，丁霄霖.山藥粗多糖的提取工藝[J].食品與生物技術學報，2006，25（3）：79-83.

[4]黃玉仙，易駿，昊巖斌，等.不同山藥種質資源的尿囊素含量比較研究[J].福建中醫(yī)藥，2011，42（2）：50-52.