水蛭提取物對(duì)人白血病HL60細(xì)胞體外抑制作用研究*

★ 肖移生 廖夫生 趙志冬 左愛(ài)仁 朱大誠(chéng)

（江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

水蛭俗稱螞蝗，性咸、苦、平，歸肝經(jīng)，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，用于治癥瘕、痞塊、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷等，其藥理作用為抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等[1]；臨床上水蛭也可單方或組方運(yùn)用于腫瘤治療中[2]。但現(xiàn)有的研究、應(yīng)用水蛭治療腫瘤是抗實(shí)體腫瘤，然而水蛭是否具有抗血液系統(tǒng)腫瘤的作用目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們采用HL-60細(xì)胞作為髓系白血病研究的工具細(xì)胞，探討水蛭提取物對(duì)其體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)方法

HL60細(xì)胞由江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存，將HL60細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中（37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)），培養(yǎng)至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基及新生小牛血清為美國(guó)GIB-CO公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 藥物

水蛭原藥材購(gòu)于江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)我校中藥生藥教研室鑒定且符合國(guó)家中藥臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。水蛭用超微粉碎機(jī)粉碎，提取物以液氮快速凍融法制備[3]：取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內(nèi)，加10mL無(wú)菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內(nèi)5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復(fù)3次，再3 000 r/min離心10min。取上清液過(guò)濾，濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆?，臨用前用培養(yǎng)基配成實(shí)驗(yàn)所需濃度工作液，再經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾器正壓過(guò)濾除菌。

1.4 HL60細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于25mL的培養(yǎng)瓶，接種濃度為1.0×105/mL，每瓶培養(yǎng)液為4mL，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組加入0.05、0.1、0.5、1.0mg/mL濃度的水蛭提取物連續(xù)處理，對(duì)照組不加藥；每隔24h隨機(jī)取樣，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞（同一處理計(jì)數(shù)10瓶細(xì)胞取平均值），光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，每毫升活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 MTT試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞以5.0×104/mL細(xì)胞濃度置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，同時(shí)用水蛭提取物（終濃度0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/mL）再處理HL60細(xì)胞48h，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔，到時(shí)間點(diǎn)后各孔加入MTT液20μL/孔，每次10復(fù)孔，4h后終止培養(yǎng)，以1 000r/min離心5min，去除上清，加入DMSO（150 μL/孔）使結(jié)晶物溶解，用自動(dòng)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，得出量效關(guān)系。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照孔A值-試驗(yàn)孔A值）／對(duì)照孔A值×100%。根據(jù)不同藥物濃度條件下細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率數(shù)值進(jìn)行相關(guān)回歸分析，并根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。以1/2 IC50含藥量作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)起始工作濃度。

1.6 克隆形成試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[4]改進(jìn)集落形成試驗(yàn)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞（1.0×103/mL細(xì)胞濃度）、10%新生小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液、各濃度水蛭提取物（根據(jù)前兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)0.7、1.4、2.8mg/mL）和終濃度為0.3%的瓊脂充分混勻，正常對(duì)照組不加水蛭提取物，然后接種于35mm培養(yǎng)皿中（1.5mL/皿），每組10個(gè)皿，置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)5d。在終止培養(yǎng)之時(shí)，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每皿集落數(shù)，≥40個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為1個(gè)集落，結(jié)果取平均值。

1.7 Hoechst33342熒光染色檢測(cè)

各個(gè)濃度水蛭提取物（設(shè)0.7、1.4、2.8mg/mL）處理HL60細(xì)胞48h后，加入終濃度為10μg/mL的Hoechst 33342并于37℃孵育30min，再加入終濃度為1%的多聚甲醛于暗處固定細(xì)胞30min。暗處離心棄上清，取細(xì)胞涂片并用封片液封片于載玻片上。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并照相。計(jì)算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)÷計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次，結(jié)果取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

正常對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)過(guò)72h完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后達(dá)到平臺(tái)期；0.05mg/mL水蛭提取物對(duì)細(xì)胞抑制不明顯；0.1-1.0mg/mL濃度的水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞有明顯的抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性。其中1.0mg/mL水蛭提取物組的細(xì)胞增殖緩慢，48h達(dá)高峰，隨后數(shù)量下降，故后續(xù)試驗(yàn)取水蛭提取物作用HL60細(xì)胞48h為觀察時(shí)間點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞的影響

2.2 水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞增殖的抑制作用

各濃度的水蛭提取物處理HL60細(xì)胞48h后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制HL60細(xì)胞增殖，抑制率隨水蛭提取物濃度增高而增加。0.05mg/mL組與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算出水蛭提取物對(duì)HL60相關(guān)抑制率的相關(guān)直線回歸方程為y（增殖抑制率）=12.364x（藥物濃度）-17.201，經(jīng)計(jì)算作用HL60細(xì)胞48h時(shí)的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL。故后續(xù)試驗(yàn)將水蛭提取物設(shè)為0.7、1.4、2.8mg/mL 3個(gè)劑量作用HL60細(xì)胞48h時(shí)間段進(jìn)行研究。

表1 水蛭提取物處理48h后對(duì)HL60細(xì)胞增殖抑制作用

2.3 水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞系克隆形成的影響

HL60細(xì)胞系克隆形成試驗(yàn)結(jié)果，正常對(duì)照組克隆數(shù)為88.4±6.5，用不同濃度的水蛭提取物作用HL60細(xì)胞48h，克隆形成明顯減少，兩者成反比關(guān)系，即藥物濃度越大，克隆形成越少。各藥物組與正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.4 水蛭提取物誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡

正常對(duì)照組HL60細(xì)胞大小一致，形態(tài)正常，細(xì)胞漿及核內(nèi)染色質(zhì)呈均勻藍(lán)色熒光；各藥物組可見(jiàn)較多的細(xì)胞表現(xiàn)為核染色質(zhì)凝集致密濃染，熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮或碎裂成2塊以上即為凋亡細(xì)胞；各藥物組凋亡細(xì)胞量較正常對(duì)照組明顯增多，且呈劑量依賴關(guān)系，與正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2、圖2。

表2 水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞系集落形成及誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，廣泛用于心腦血管及血栓性疾病的治療，水蛭也是腫瘤疾病治療中常用的一味活血藥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水蛭抗腫瘤的主要活性成份有凝血酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等，含量中主要是水蛭素、溶纖素等，這些都是小分子肽，對(duì)熱敏感。不同的提取方法，會(huì)極大的影響水蛭藥效[5]。本研究采用液氮快速凍融法制備水蛭提取物，這種低溫炮制工藝可以有效減少和防止炮制過(guò)程中水蛭多肽和蛋白類活性成分的降解與變性失活，從而顯著提高了藥效[6、7]。

本課題組進(jìn)行了水蛭提取物抗人白血病HL60細(xì)胞體外增殖藥效研究，發(fā)現(xiàn)水蛭提取物濃度高于0.1mg/mL時(shí)對(duì)HL60細(xì)胞有明顯的抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性。經(jīng)計(jì)算作用HL60細(xì)胞48h時(shí)的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故后續(xù)試驗(yàn)將水蛭提取物設(shè)為0.7、1.4、2.8mg/mL 3個(gè)劑量作用HL60細(xì)胞48h時(shí)間段進(jìn)行研究。運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)0.7-2.8mg/mL濃度的水蛭提取物作用HL60細(xì)胞48h，藥物濃度越大，克隆形成越少，克隆形成與藥物濃度成反比。這進(jìn)一步說(shuō)明水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞有明顯的抑制作用。

田雪飛等[8]運(yùn)用MTT檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)水蛭提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有體外抑制作用的范圍在3.0-15mg/mL，其作用HepG2細(xì)胞48h時(shí)的半數(shù)有效抑制濃度IC50=6.0mg/mL。運(yùn)用同樣的方法制備水蛭提取物，我們得出水蛭提取物作用HL60細(xì)胞48h時(shí)的IC50=1.4mg/mL。兩者相差較大，可能是細(xì)胞不同，對(duì)藥物的敏感也不同所致。運(yùn)用Hoechst33342熒光檢測(cè)結(jié)果，0.7、1.4、2.8mg/mL提取物誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡率分別為18.45±5.25、25.61±7.70、30.38±6.89，說(shuō)明水蛭提取物有一定的誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡作用。這也是水蛭提取物對(duì)HL60細(xì)胞抑制機(jī)理之一，但詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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