精子發(fā)生的基因調(diào)控及其在犬中的研究展望

魏榮興，熊 前，徐 明

(公安部南昌警犬基地，江西 南昌330100)

精子在睪丸內(nèi)形成的過程稱為精子的發(fā)生。精子發(fā)生及調(diào)控一直是生殖生物學領域的重點研究內(nèi)容。犬睪丸產(chǎn)生精子的能力受限于遺傳，并受垂體促性腺激素和其他因素的控制和影響，這些因素有些間接通過垂體發(fā)揮作用，有些直接作用于睪丸組織［1］?；虻谋磉_和調(diào)控對精子發(fā)生的能力和質(zhì)量起著至關重要的作用。在人類中，有絲分裂階段的精原細胞中有405 個基因表達; 精母細胞中無DNA 復制，但許多基因參與這個過程中的基因重組與DNA 修復，其中有442個基因在精母細胞中高度表達，在減數(shù)分裂后的精子細胞中有175 個基因表達［2］。

1 犬精子發(fā)生過程

精子在睪丸的曲細精管部位生成，其上皮主要由兩種細胞構成，即生精細胞和營養(yǎng)(支持) 細胞。生精細胞的依次分裂及分化就是精子發(fā)生過程。犬一般在出生時曲細精管還沒有管腔，只有性原細胞和未分化細胞，二者在胎兒期就已形成，精子發(fā)生始于性原細胞變成精原細胞。由精原細胞發(fā)生為精子，必須經(jīng)過復雜的分裂和形成過程，大致可以分為四個階段。第一階段為A 型精原細胞分裂為A1 型和A2 型精原細胞，由A2 型精原細胞分裂而成中間型精原細胞，中間型精原細胞分裂增殖而成的B 型精原細胞，B 型精原細胞經(jīng)4 次分裂，先后分裂成為16 個初級精母細胞，這時曲細精管開始出現(xiàn)管腔，此階段需要時間約為14 d; 第二階段為初級精母細胞進行第一次成熟分裂成為2個次級精母細胞，此階段需要時間約為21 d;第三階段是由次級精母細胞再分裂為2 個精細胞，并移近至曲細精管管腔，附著在營養(yǎng)細胞尖端，此階段需要時間約為0.5 d; 第四階段為精細胞從營養(yǎng)細胞獲得發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)形態(tài)改變，細胞核成為精子頭的主要部分(含遺傳物質(zhì)DNA) ，高爾基體成為頂體，中心小體則變?yōu)榫游驳?，并進入精細管腔內(nèi)，這個過程也稱為精子的形成，需要時間約為10.5 d［1］。

2 基因調(diào)控

2.1 CAMP 應答元件調(diào)節(jié)因子

CREM 是CAMP 應答元件結合蛋白(CAMP response eleme binding protein，CREB) 的家族成員，是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在各種組織中均有表達，但是在睪丸的濃度比其他任何組織要高100 倍［3］。該家族基因的靶基因調(diào)節(jié)區(qū)域上都含有CREs，如轉(zhuǎn)換蛋白TP1 和TP2、前頂體蛋白(Proacrosin) 和鈣精蛋白(Calspermin) 、精蛋白PN1 和PN2編碼的基因。這些基因的啟動子都有CREs。CREs 是由一個保守的回文系列TGACGTCA構成。CREM 通過識別并結合到靶基因的CRE 上，對靶基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。CREM 的表達主要集中在次級精母細胞和精子細胞中。該基因?qū)拥某墒焓潜仨毜模诰影l(fā)生中特別是減數(shù)分裂后階段發(fā)揮至關重要的作用。精母細胞完成減數(shù)分裂后，許多生殖細胞高度特異性的減數(shù)分裂后基因(post meotic gene) 都包含CAMP 應答元件，接受CAMP 的調(diào)控［4］。在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，敲除了CREM 的小鼠睪丸內(nèi)，一些非常重要的精子所必須的減數(shù)分裂后基因表達缺失，如魚精蛋白1 和2 及轉(zhuǎn)型蛋白，從而阻斷了細胞分化，最終使精細胞發(fā)生凋亡，精子發(fā)育停留在圓形精子階段，導致小鼠的不孕不育［5］。同時，CREM 敲除小鼠的睪丸重量比正常小鼠小20% ～25%，精細胞數(shù)量比正常的少46%［6］。CREM 含有許多功能結構域，包括與DNA 接合及形成二聚體所必需的C端亮氨酸拉鏈結構域、富含谷氨酰胺的活性結構域，以及側(cè)翼區(qū)域的磷酸受體區(qū)域-P盒［7］。CREM 的轉(zhuǎn)錄還受到促卵泡激素的調(diào)控。Foulkes［8］發(fā)現(xiàn)，沒有分泌FSH 的倉鼠的睪丸內(nèi)也沒有CREM 轉(zhuǎn)錄，但當注射了FSH 后，倉鼠睪丸內(nèi)CREM 的轉(zhuǎn)錄迅速增加。睪丸CREM 的活性依賴與它的激活子蛋白(Activator of CREM in testes，ACT) 。ACT具有活性結構域，能夠激活CREM 的表達，并且具有表達組織特異性。Kotaja 等［9］通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠中敲除ACT 雖然可以完成精子分化過程，產(chǎn)生成熟的精子，但是成熟精子的數(shù)量卻非常少，并且有許多形態(tài)異常和無運動能力的精子，這說明ACT 在精子成型的調(diào)控過程中起了重要作用。

在犬中，CREM 位于2 號染色體的1755522-1805805 位置。Uyttersprot N 等［10］對其進行了全測序發(fā)現(xiàn)，犬CREM 編碼的氨基酸序列跟鼠和人的同源氨基酸序列匹配率分別為94.5%和91.0%。他利用三種不同探針的RNA 酶保護測定法(RPA) 在多種犬組織中分析了多種CREM 轉(zhuǎn)錄本的表達情況。發(fā)現(xiàn)CREM 轉(zhuǎn)錄因子有很強的組織特異表達，它的活化因子和抑制因子在不同組織的比例也相當不同。另外，他通過RT- PCR發(fā)現(xiàn)了兩個CREM 異構體。然而，目前國際上還鮮有關于CREM 在犬精子發(fā)生、發(fā)育中的具體功能性研究。

2.2 TSPY 基因

TSPY(testis-specific protein Y-encoded)基因在睪丸中為特異性表達，該基因主要表達于精原細胞階段，其作用是與精子的分化和增殖有關［11］。也有報道稱，TSPY 表達于精母細胞階段，其參與了精子變態(tài)，總之TSPY 缺失可導致精子發(fā)生障礙。

在人類中，TSPY1 基因存在大概21 ～35的拷貝數(shù)變異。該基因的表達模式和預測功能表明，它可能與精子的發(fā)生有關。為了證明這點，Giachini C 等以意大利中部的154個不孕不育患者和130 個正常個體的精子為樣本，通過q-PCR 實驗得出，TSPY1 與精子發(fā)生的數(shù)量呈極顯著相關(P ＜0.001) ，并且，低于33 拷貝數(shù)的樣本個體的精子有不正常參數(shù)的幾率是大于33 拷貝數(shù)樣本個體的1.5 倍(P ＜0.001) 。這表明TSPY1 與精子發(fā)生效率有很強相關，并且低拷貝數(shù)的個體更容易不孕不育［12］。但是Nickkholgh B等，以荷蘭的100 名低生育能力的個體和100 名正常個體的精子為樣本，通過q-PCR和Southern blot 印跡雜交的辦法，發(fā)現(xiàn)TSPY的拷貝數(shù)和精子質(zhì)量并沒有顯著的統(tǒng)計學相關［13］。由此可知，TSPY 的拷貝數(shù)對精子發(fā)生和質(zhì)量的影響是個非常復雜的問題，需要進一步在功能上進行研究和驗證才能下結論。

另外，該基因與生殖細胞的癌變有很強相關性，它位于性腺母細胞瘤的臨界區(qū)域，它在生殖細胞腫瘤和性腺母細胞瘤中優(yōu)先表達，并且它與精原細胞瘤和前列腺癌的發(fā)生也有很強相關性［13，14］。

在犬中，在12 號染色體的71935792 至71953959 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了TSPY1 的同源基因，但是對于其在犬中的功能上的作用和機制，目前尚未有相關研究。

2.3 SOX 基因

SOX(SRY-related high mobility group-box gene) 基因是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關基因，是與位于Y 染色體上的SRY 基因(Sex determing region of Y chromosome) 的正下游，該基因負責調(diào)控睪丸的形成。

目前發(fā)現(xiàn)的該基因家族有20 多個SOX因子中，部分可能跟精子發(fā)生有關，比如E組的SOX8、SOX9 和SOX10 在支持細胞中重疊表達。SOX9 在睪丸生精小管上皮細胞呈階段特異性表達。Good fellow 等發(fā)現(xiàn)，SOX9 在雄鼠胚胎的睪丸形成中表達，而在雌鼠的胚胎中不表達［15］; 在后續(xù)研究中，Good fellow 等克隆了SOX9 基因，發(fā)現(xiàn)它與SRY 氨基酸的高可變區(qū)盒(High- mobility group box，HMG BOX) 的同源性大于60%，在睪丸的發(fā)育中作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游基因的表達。SRY 基因不是直接調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育而是通過SOX9 共同作用才發(fā)生作用［16］。

SOX 家族廣泛活躍于哺乳動物的多種功能調(diào)節(jié)中。犬的SOX9 同源基因位于9 號染色體的8275049 至8278172 區(qū)域。有報道稱，SOX9 基因可能跟犬的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象有關［17］。關于其在精子發(fā)生上的作用機制，還在研究過程中。

2.4 HSF 熱休克因子

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是生物體(或離體培養(yǎng)的細胞) 在不良環(huán)境因素作用下產(chǎn)生的具有高度保守性的應激蛋白，普遍存在于整個生物界，是一類功能性相關蛋白質(zhì)。當細胞受到升高溫度或其他壓力時它們的表達就會增長［18］，這種表達的增長是受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。

在不存在熱休克時，HSF 也調(diào)控著精子發(fā)生基因的表達［19］。過表達HSF1 轉(zhuǎn)基因小鼠的精子發(fā)生阻滯，敲除HSF2 轉(zhuǎn)基因小鼠生育能力低，精子數(shù)量比正常小鼠少70%，睪丸重量減少，精原細胞大量死亡。表明HSF2 與生殖細胞的減數(shù)分裂和存活有關［20］。

HSF 是犬的一個非常重要的基因，熱休克反應和精子發(fā)生都是犬的非常重要的性狀。這個基因在動物中是個非常保守的基因。在犬中的同源基因位于1 號染色體。目前關于其在犬中的功能上的研究很少，非常值得深入研究。

3 展望

犬的精子發(fā)生是個非常復雜而又重要的性狀，其中基因?qū)ζ溆绊懯遣豢珊鲆暤?。上文描述了部分比較重要的基因。目前這些基因在人類、小鼠等其它哺乳動物中研究較為深入和廣泛，在犬中，類似的研究卻較為匱乏。雖然，由于哺乳動物基因組的相似和同源的特性，犬的精子發(fā)生基因的研究可以從其他哺乳動物的研究中得到很好的借鑒和方向，但是相關基因在犬中具體的功能和作用機制必須依靠后續(xù)的實驗研究和功能驗證才能確定。

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