張惠青，趙國樑

(北京服裝學院材料科學與工程學院，北京 100029)

聚酯(PET)因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，機械性能好，在體內(nèi)不易降解等優(yōu)點，多年來被廣泛用于制造人造血管等醫(yī)用紡織材料［1］。但因PET 分子結(jié)構(gòu)較規(guī)整，結(jié)晶度較高，結(jié)構(gòu)中無強極性基團，親水性較差，目前其血液相容性尚不能滿足應(yīng)用要求［2］，限制了PET 纖維紡織品在與血液直接接觸的植入性醫(yī)用材料方面的應(yīng)用。肝素作為一種天然的生物活性物質(zhì)，具有很強的抗凝血性能［3］。為提高植入性PET 材料的血液相容性，可首先在PET 表面引入對肝素具有反應(yīng)能力的間隔基團或空間臂［3－4］，如氨基和丙烯酸(AA)中的羧基，再在催化劑作用下使間隔基團與肝素中的羧基或磺胺基反應(yīng)，實現(xiàn)PET 的表面肝素化［3］。

雖然PET 表面化學結(jié)合的肝素鈉(Hep)可通過X 射線光電子能譜(XPS)［5－6］及Hep 改性前后材料表面性能的變化等方法［5］進行表征，但XPS 并不適用于所有基體材料，而測定改性后PET 接觸角的方法無法對Hep 接枝量進行準確定量。

近年來，一些研究者采用甲苯胺藍(TB)分光光度法對共混材料Hep 釋放量［7］、瓊脂4B 上Hep 的固定量［8］及絲素薄膜表面Hep 的接枝量［9］等進行表征，并對TB 聚集及其影響因素［10］、TB 由聚陰離子量子點引起的顏色變化［11］等問題進行了探究。然而，對于在引入Hep 時所引入的具有極性的間隔基團對陽離子染料TB 存在吸附的問題尚無很好的解決方法，影響了結(jié)構(gòu)表征的精確度。因此，進一步完善TB 分光光度法，使之更準確、快捷地對PET 表面Hep 進行表征，對制備具有抗凝血功能的PET 纖維及其生物醫(yī)用紡織材料具有重要意義。

1 實驗

1.1 原料

AA:分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司產(chǎn);氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、正己烷:均為分析純，北京化工廠產(chǎn);過氧化二苯甲酰(化學純)、Hep，TB:國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)。

1.2 儀器

721W 可見分光光度計:上海光學儀器五廠制造;RPB10 筆式pH 計:上海羅素科技有限公司制造。

1.3 實驗方法

PET-AA 及PET-AA-Hep 薄膜的制備:將PET薄膜和AA 加入水中，通入氮氣，升至所需溫度后，加入引發(fā)劑過氧化二苯甲酰，反應(yīng)一定時間，制備PET-AA 薄膜;在含有Hep 的水溶液中加入含有N，N-二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液和PET-AA，室溫反應(yīng)24 h，制備PET-AA-Hep 薄膜。

PET 及PET-AA 的吸附實驗:將PET-AA 置于pH 值為7.4 的TB 溶液中一段時間，取出PETAA，利用分光光度計在674 nm 波長下測得TB 殘液的吸光度，而后重復(fù)上述過程。

pH 值對PET-AA 吸附TB 的影響實驗:稱取相同質(zhì)量的PET-AA 放入不同pH 值下體積濃度40 μg/mL TB 溶液中相同時間后，取出PET-AA測定TB 殘液的吸光度，并計算單位質(zhì)量PET-AA在不同pH 值下所引起的殘液吸光度變化。

pH 值對離子鍵結(jié)合的影響實驗:將20 μg/mL Hep 與不同pH 值下40 μg/mL TB 溶液進行等量混合并振蕩一定時間后，測量混合溶液的pH 值和吸光度。

校正曲線的標定:在用HCl 調(diào)節(jié)為特定pH值且含有0.2% NaCl 的40 μg/mL TB 溶液中加入用pH 值為7.4 的Na2HPO4和NaH2PO4配置緩沖溶液(PBS)配置的不同濃度的Hep 溶液。而后加入正己烷，振蕩1 min 后，取下層溶液進行校正曲線的繪制。

PBS 洗滌PET-AA-Hep 的實驗:用固定浴比的PBS 緩沖溶液浸泡PET-AA-Hep 薄膜一段時間后，取出薄膜，按校正曲線測定過程測試，并重復(fù)以上過程。

PET-AA-Hep 表面含量的測定:PET-AA-Hep經(jīng)過PBS 溶液(PET-AA-Hep∶PBS 質(zhì)量比為1∶200，每6 h 換一次溶液)洗滌60 h 后晾干，置于pH 為1.0 的TB 溶液中振蕩一定時間后測定吸光度經(jīng)校正曲線換算得表面Hep 含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 PET-AA 對TB 的吸附曲線

由圖1 可知:對于未經(jīng)AA 改性的PET 薄膜進行上述實驗時發(fā)現(xiàn)，PET 薄膜從TB 溶液中取出后，薄膜仍為無色，TB 殘液吸光度無明顯變化，說明PET 薄膜對TB 無明顯吸附作用;而對于PET-AA 薄膜，隨時間增加，TB 殘液吸光度逐漸下降，下降速率逐漸減小。這是因為PET-AA 從TB溶液中取出后，TB 吸附在薄膜上，顏色由藍色變?yōu)樽仙蕳l紋狀分布，隨時間增加，顏色越來越深，PET-AA 薄膜上吸附的TB 逐漸增多，導(dǎo)致吸光度逐漸下降。TB 沉積在表面活性素上時，分布在活性素膠束狀溝槽中［12］，這類似于本研究中TB 沉積在PET-AA 膠束狀的溝槽，從而呈現(xiàn)紫色條紋狀分布的現(xiàn)象。TB 在PET-AA 薄膜上由藍色變?yōu)樽仙怯捎赥B 在陰離子表面排列構(gòu)型有所變化所致［8］。

圖1 PET-AA 和PET 對TB 的吸附曲線Fig.1 Adsorption curves of TB on PET-AA and PET

2.2 pH 值對PET-AA 吸附TB 的影響

由圖2 可知，相同TB 濃度與相同質(zhì)量PETAA 下，隨pH 值下降，殘液吸光度減小。因隨時間的增加，PET-AA 上吸附的TB 逐漸增加，導(dǎo)致殘液吸光度逐漸下降，在TB 溶液中停留時間相同的PET-AA 薄膜，在其質(zhì)量和密度均一致時，殘液吸光度的變化只與pH 值有關(guān)，故殘液吸光度變化可表明吸附作用的大小。殘液吸光度與原TB 溶液吸光度相差越小，吸附作用越小，即PETAA 引起TB 溶液吸光度改變越小，吸附作用越小。

圖2 pH 值對PET-AA 吸附TB 的影響Fig.2 Effect of pH value on TB adsorption on PET-AA

由圖2 還可知，pH 值對PET-AA 吸附TB 的影響不成正比例，在pH 值下降過程中，起初影響較大，隨著pH 值的降低，其對吸附的影響力逐漸減小。實驗中發(fā)現(xiàn)，在pH 值為1.2 時，PET-AA對TB 幾乎無吸附作用，且在pH 值小于2.5 時，吸附在PET-AA 表面的TB 由紫色變?yōu)樗{色，這可能是由于在pH 值逐漸減小時使TB 的構(gòu)型發(fā)生了轉(zhuǎn)變所致［13］。

2.3 pH 值對于TB-Hep 鍵合的影響

由圖3 可見，隨pH 值下降，含有Hep 的TB溶液的吸光度逐漸上升。實驗中發(fā)現(xiàn)，不含Hep的TB 溶液的吸光度與pH 值無關(guān);Hep 加入TB溶液后可導(dǎo)致TB 顏色改變從而使最大吸收波長向低波長方向移動60～70 nm，通過加入輕汽油移除TB-Hep 復(fù)合物的方法可提高分光光度法的準確性，但不移除TB-Hep 復(fù)合物對分光光度法的準確性影響也不大［8］，故本研究中采用不加正己烷的方法可表明pH 值對TB-Hep 鍵合的影響。本實驗中HCl 體積分數(shù)高達6.25%時，含有Hep的TB 溶液pH 值為－0.3，其吸光度為0.690，與不含有Hep 的20 μg/mL TB 溶液的吸光度0.903有一定差距;若Hep-TB 離子鍵結(jié)合完全被破壞，則在pH 值為－0.3，含Hep 的TB 溶液吸光度應(yīng)為0.903，故可認為pH 值的改變對Hep 與TB 離子鍵的結(jié)合有略微影響，不會導(dǎo)致離子鍵結(jié)合的完全破壞。

圖3 pH 值對Hep 與TB 之間離子鍵結(jié)合的影響Fig.3 Effect of pH value on ionic bond between Hep and TB

pH 值下降不能完全破壞Hep 與TB 之間的離子鍵結(jié)合，只對其鍵合略有影響;pH 值小于等于1.2 時，PET-AA 對TB 幾乎無吸附，故可采用pH 值小于等于1.2 的TB 溶液來標定薄膜表面Hep 的校準曲線。

2.4 校準曲線的確定

由圖4 可知，隨著Hep 濃度的增加，TB 殘液吸光度起初迅速下降，而后下降平緩。這是因為Hep 濃度低時，TB-Hep 的鍵合迅速增加，殘液吸光度迅速下降，當Hep 濃度達到一定濃度后，其TB-Hep 的鍵合緩慢，殘液吸光度也下降緩慢。由圖4b 可知，Hep 濃度為0～10 μg/mL 時的TB 殘液吸光度的變化與Hep 濃度呈線性擬合，其擬合方程為:

擬合曲線線性相關(guān)性很高，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998 72。因此，pH 值為1.0，濃度為40 μg/mL 的TB 溶液可作為標定Hep 濃度的標準溶液，擬合曲線可作為校正曲線。

圖4 pH 值為1.0 時Hep 的校正曲線及其擬合曲線Fig.4 Calibration and fitting curves of Hep at pH value of 1.0

2.5 PET 表面吸附Hep 的洗除

由圖5 可看出，隨著洗滌時間增加，殘液的吸光度逐漸增加，在54 h 后其吸光度基本趨于平衡，與不含Hep 時TB 溶液的吸光度一致。

圖5 PBS 洗滌PET-AA-Hep 的殘液吸光度與時間的關(guān)系Fig.5 Plots of absorbance versus time for PET-AA-Hep residual liquid after washing with PBS solution

因人體血液環(huán)境pH 值為7.35～7.45，如其用于體內(nèi)環(huán)境，經(jīng)過pH 值為7.4 的PBS 緩沖溶液充分洗滌PET-AA-Hep 后，可完全洗除吸附在PET 表面的Hep，剩余的Hep 與PET-AA 的結(jié)合為化學結(jié)合。確定出PBS 洗滌條件為:PET-AAHep 與PBS 溶液的比例為1∶200，6 h 換一次PBS 溶液共洗滌60 h。

當PET-AA-Hep 從TB 溶液取出后，選擇TB濃度為40 μg/mL，pH 值為1.0 對Hep 進行校準曲線標定，測得吸光度為0.818，經(jīng)此校準曲線計算得Hep 接枝量為54.364 μg/g。

3 結(jié)論

a.降低TB 溶液pH 值可延緩PET-AA 對TB的吸附，pH 值小于等于1.2 時PET-AA 對TB 幾乎無吸附，對TB-Hep 離子鍵合略有影響，并不影響Hep 校正曲線的標定。

b.用PBS 洗滌方法證明了PET-AA 結(jié)合的Hep 不是以吸附的形式，而是以化學鍵結(jié)合，確定洗滌條件為:浴比1∶200，6 h 換一次PBS 溶液共洗滌60 h。選擇TB 濃度為40 μg/mL，pH 值為1.0 對Hep 進行校準曲線標定，并計算出PET-AA接枝Hep 的接枝量為54.364 μg/g。

［1］敖偉，陳南梁.國外人造血管的發(fā)展［J］.產(chǎn)業(yè)用紡織品，2000，18(12):1－4.

［2］許海軍，趙國樑，王曉春，等.陽離子染料可染聚酯抗凝血性能研究［J］.合成纖維工業(yè)，2006，29(3):28－30.

［3］李娟，吳英鋒，楊新林.肝素功能化生物材料的研究進展［J］.有機化學，2010，30(3):359－367.

［4］Ma Xinghang，Mohammad S F，Kim S W.Interaction of heparin with polyallylamine-immobilized surfaces［J］.J Biomed Mater Res，1993，27(3):357－365 .

［5］Han D K，Park K D，Ahn K D，et al.Preparation and surface characterization of PEO-grafted and heparin-immobilized polyurethanes［J］.J Biomed Mater Res:Appl Biomater，1989，23(A1):87－104.

［6］Li Jing，Huang Xiaojun，Ji Jing，et al.Covalent heparin modification of apolysulfone flat sheet membrane for selective removal of low-density lipoproteins:A simple and versatile method［J］.Macromol Biosci，2011，11(9):1218－1226.

［7］劉秀英，張超燦，徐衛(wèi)林.甲苯胺藍分光光度法測定肝素鈉的研究［J］.化學試劑，2009，31(4):271－274.

［8］Smith P K，Mallia A K，Hermanson G T.Colorimetric method for the assay of heparin content in immobilized heparin preparations［J］.Anal Biochem，1980，109(2):466－473.

［9］葉勇，張韻劍，黃龍全.絲素表面接枝肝素分子的反應(yīng)條件與體外抗凝血作用［J］.蠶業(yè)科學，2007，33(1):74－78.

［10］D 'Ilario L，F(xiàn)rancolini I，Martinelli A，et al.Insight into the heparin-toluidine blue (C.I.Basic Blue 17)interaction［J］.Dye Pigment，2009，80(3):343－348.

［11］Gattas-Asfura K M，Naistat D M，Leblanc R M.Color change of toluidine blue induced by polyanionic quantum dots［J］.Colloids Surf A，2006，282/283:471－474.

［12］Liu Jing，Zou Aihua，Mu Bozhong.Toluidine blue:Aggregation properties and distribution behavior in surfactin micelle solution［J］.Colloids Surf B，2010，75(2):496－500.

［13］Macintosha F C.A colorimetric method for the standardization of heparin preparations ［J］.Biochem J，1941，35(7):776－782.