饒家珍 唐瑾秋 劉曉璇 蒙向欣 趙 威 于曉瑜 陳家湄 李 娟 俸 維

（廣州市中醫(yī)醫(yī)院·510130）

糖尿病腎?。―iabetic Kidney Disease,DKD）是糖尿病患者主要死亡原因之一,是糖尿病常見(jiàn)微血管并發(fā)癥之一，其病理變化包括：腎臟肥大，腎小球及腎小管基底膜增厚、腎小球基質(zhì)增生，腎間質(zhì)纖維化、硬化等，其中腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells，MCs）增生肥大和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積聚被認(rèn)為與DN 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。因此抑制MCs 增生，減少ECM 積聚，對(duì)防治DN具有重要的臨床價(jià)值。加味芪黃飲是饒家珍老師的經(jīng)驗(yàn)方，由太子參、黃芪、生地、澤瀉、山茱萸、山藥、茯苓、丹皮、蟬蛻、溪黃草、白茅根組成。由六味地黃丸加減而來(lái)，以益氣養(yǎng)腎，利尿攝精為法；六味地黃湯具有提高免疫功能,恢復(fù)損傷的腎功能,降低蛋白尿，尿素氮,并能抗氧化。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，加味芪黃飲可以減輕早期DN 腎小球、腎小管的損害，緩解腎功能損傷，有效阻止早期DN 的進(jìn)展，減少早期DN 的腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變[2-3]。本研究觀察加味芪黃飲對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分之一纖維連接蛋（fibronectin,FN）的影響,從p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信號(hào)通路方面探討其可能的作用機(jī)制,初步探討加味芪黃飲對(duì)糖尿病腎病的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠100 只，雌雄各半，SPF 級(jí)，體重150～180g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):0108386,用于加味芪黃飲中藥含藥血清制備。

1.1.2 細(xì)胞來(lái)源 大鼠腎小球系膜細(xì)胞系（HBZY-1）,購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC 中國(guó)武漢大學(xué)）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑、儀器 SB203580（p38MAPK 抑制劑,Sigma 公司）；D2 甘露醇（超純級(jí),MBCHEM 公司）；D2（+）2 葡萄糖（Sigma 公司純度≥99.5%）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）、抗鼠FN 一抗（Santa Cruz 公司）；抗鼠磷酸化p38 一抗、抗鼠磷酸化CREB 一抗（Cell Signaling 公司）；抗鼠二抗（Santa Cruz 公司）。pbs 液（上海雙螺旋）、胰酶（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院）純水儀：美國(guó)Millipore 公司Q-Plus 電子分析天平：德國(guó)Sartorius，d=0.1mg 多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN 臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman 細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本SANYO 公司倒置顯微鏡：OLYMPUS，PM-10AD，超凈工作臺(tái)：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)發(fā)展有限公司，自動(dòng)高壓滅菌器：HVE-50，日本平山（Hirayama）公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制 加味芪黃飲中藥（太子參、黃芪、生地、澤瀉、山茱萸、山藥、茯苓、丹皮、蟬蛻、溪黃草、白茅根）生藥由廣州市中醫(yī)醫(yī)院提供，中藥湯劑在實(shí)驗(yàn)室制備，藥物水煎、過(guò)濾、濃縮至含生藥2.5×103g.L-1，分裝滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?00 只大鼠隨機(jī)分為加味芪黃飲中藥血清組，正常大鼠組，每組50 只，中藥血清組大鼠按200mg/kg 加味芪黃飲方劑量每1g 中藥，34g/kg 加味芪黃飲總方劑量，以成人劑量每kg 的12.1 倍，灌喂中藥煎劑，正常大鼠組灌喂同等中藥煎劑量的生理鹽水；每日分2 次給藥，連續(xù)給藥3d，末次給藥1h 后下腔靜脈取血，無(wú)菌分離血清，兩組血清各自合并后經(jīng)56℃、30min 滅活，0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（HBZY21）常規(guī)培養(yǎng)于含20%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基中（加100ku·L-1青霉素,100mg·L-1鏈霉素）,培養(yǎng)條件為37℃,飽和濕度5%CO2。每2～3d 用含0.04%EDTA 的胰酶消化傳代,傳代后第3～5 代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與用藥 用胰酶消化貼壁的系膜細(xì)胞，經(jīng)離心，吹打，混勻，稀釋成相應(yīng)的密度（2.5×107·L-1）接種至60mm 培養(yǎng)皿中,常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)近融合時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)24h 同步化后，按照不同實(shí)驗(yàn)要求，給予高糖（或甘露醇）和藥物刺激24h，收集細(xì)胞用于Western blot 檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為6 組：（1）正常組：5.6mmol/L-1gluose；（2）甘露醇組，作為高滲對(duì)照組：5.6mmol/L-1glucose+24.4mmol/L-1mannito；（3） 高 糖 組：30mmol/L-1glucose；（4）SB203580 組：30mmol/L-1glucose+10μmol/L-SB203580；（5）加味芪黃飲低劑量組：30mmol/L-1glucose+10%含加味芪黃飲含藥血清（0.5ml 含藥血清+4.5ml 無(wú)血清MEM 培養(yǎng)基）；加味芪黃飲高劑量組：30mmol/L-1glucose20%含加味芪黃飲含藥血清（1ml含藥血清+4ml 無(wú)血清MEM 培養(yǎng)基）；各組均加入正常大鼠血清和MEM 培養(yǎng)基，使血清終濃度為20%。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)大鼠腎小球系膜細(xì)胞纖維連接蛋白、p38MAPK、p-CREB 蛋白表達(dá)水平 分組藥物干預(yù)24h 后。終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用冷PBS 漂洗細(xì)胞1～2 次，空干后，加裂解液70μl/皿,用細(xì)胞刮子刮下培養(yǎng)皿底的細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液至1.5mlEP 管中，BCA 蛋白定量法測(cè)定各組蛋白質(zhì)含量經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì),每孔上樣量40μg 總蛋白。用Bio-Rad 電轉(zhuǎn)儀將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，卸下電泳裝置，把硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜放入盛有5%脫脂奶粉封閉液中，封閉1h。封閉完畢后用PBST洗膜5次，每次間隔5分鐘，加一抗（抗鼠FN一抗（1∶200）抗鼠p38MAPK 一抗（1 ∶2000）、抗鼠磷酸化CREB（1 ∶2000）），4°孵育過(guò)夜，次日洗膜3 次每次間隔5 分鐘。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠二抗（1 ∶2000），室溫孵育1h。洗膜5 次每次間隔5 分鐘。洗膜后取ECL 熒光底物（Pierce 公司，貨號(hào)：37071）A 液和B 液各1mL，混勻后，將PVDF 膜浸泡其中，室溫孵育3-5 分鐘后，用濾紙將PVDF 膜表面液體擦干，并將其置于暗室，取醫(yī)用X 光底片覆蓋，曝光1 分鐘后，依次顯影、定影。美國(guó)UVP 公司lab works4.5 凝膠蛋白分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究結(jié)果采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料用±S 表示,組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）,方差齊者采用LSD 法,方差不齊采用Tamhane’s T2 法,P<0.05 為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞FN 的影響

高糖組的FN 的表達(dá)與正常組相比明顯增加（P<0.05）。與高糖組組相比較,sb203580 組和加味芪黃飲低劑量組、加味芪黃飲高劑量組的FN 表達(dá)均明顯減少（P<0.05）。加味芪黃飲低劑量組與sb203580 組相比FN 的表達(dá)升高（P<0.05），加味芪黃飲高劑量組FN 表達(dá)的減少與sb203580 組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05），加味芪黃飲高劑量組與加味芪黃飲低劑量組相比FN 的表達(dá)降低（P<0.05）。甘露醇與正常組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.2 對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞p38MAPK 蛋白的影響

高糖組的磷酸化p38MAPK 的表達(dá)水平與正常組相比明顯升高（P<0.05）。與高糖組組相比較,sb203580 組和加味芪黃飲低劑量組、加味芪黃飲高劑量組的磷酸化p38MAPK 表達(dá)明顯減少（P<0.05）,sb203580 組、加味芪黃飲低劑量組、加味芪黃飲高劑量組組間差異有顯著性（P<0.05），加味芪黃飲組較sb203580 組p38MAPK 的表達(dá)水平降低（P<0.05）。甘露醇與正常組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.3 對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞磷酸化CREB 的影響

高糖組的磷酸化CREB 的表達(dá)與正常組相比明顯增加（P<0.05）。與高糖組相比較,sb203580 組和加味芪黃飲低劑量組、加味芪黃飲低劑量組的磷酸化CREB 表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）,加味芪黃飲低劑量組與sb203580 組組間差異無(wú)顯著性（P>0.05），加味芪黃飲高劑量組與sb203580 組相比CREB 表達(dá)降低（P<0.05）。

加味芪黃飲高劑量組與加味芪黃飲低劑量組相比CREB 的表達(dá)降低（P<0.05）。

甘露醇與正常組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

與正常組相比，﹡P < 0.05，﹠P > 0.05；與高糖組相比，﹟P < 0.05；與sb203580 組相比，☆P < 0.05，★P > 0.05；與加味芪黃飲低劑量組相比：△P < 0.05（其中加味芪黃飲低劑量組與sb203580 組相比FN 的表達(dá)升高P < 0.05）

3 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DKD 的形成多因先天不足，五臟虛弱，病位在肺、脾、腎，以腎為主。我們認(rèn)為DKD 為本虛標(biāo)實(shí)之證，主要病機(jī)為氣陰兩虛、濕濁內(nèi)蘊(yùn)，氣陰兩虛氣血運(yùn)行不暢，濕濁久蘊(yùn)體內(nèi)，損傷機(jī)體經(jīng)絡(luò)，日久漸成微小癥積，發(fā)為本病。故擬益氣養(yǎng)腎，利尿攝精為法。其中黃芪為補(bǔ)氣要藥，善補(bǔ)脾氣，又具利水祛濕，能實(shí)土封堤，攝血藏精，為君藥太子參補(bǔ)中益氣，津生血復(fù)；生地黃與黃芪，太子參相配，互相促進(jìn)，增其補(bǔ)益之功；山茱萸、山藥滋補(bǔ)肝腎，澀精固脫共為臣藥；山藥尚健脾補(bǔ)虛；五藥相配，滋養(yǎng)肝脾腎。茯苓補(bǔ)氣健脾，澤瀉利濕泄?jié)?，二藥為佐藥；丹皮、溪黃草清熱涼血、活血化瘀為使藥。白茅根涼血止血，蟬蛻本為疏風(fēng)之藥，用在此處可降低蛋白尿。全方補(bǔ)瀉兼顧，共奏益氣養(yǎng)腎，利尿攝精之功，臨床療效頗佳。我們前期也做了一些相關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，證明此方可延緩DKD 的發(fā)生發(fā)展[2,3]。

DKD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確。目前多認(rèn)為其發(fā)病與遺傳因素，高血糖導(dǎo)致的一系列代謝紊亂[4]，及血流動(dòng)力學(xué)改變，腎小球功能異常，蛋白的非酶糖化，山梨醇代謝途徑亢盛等因素有關(guān)，而且氧化應(yīng)激和羧基應(yīng)激損傷也參與了DKD 的發(fā)病過(guò)程，尤其與腎小球系膜細(xì)胞增殖、系膜增厚密切相關(guān)[5]。高血糖,胰島素抵抗,是導(dǎo)致DKD 的主要原因,其中高血糖可由不同途徑損害腎臟，這些損害可以累及腎臟所有結(jié)構(gòu)。系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)最活躍的固有細(xì)胞,具有產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、分泌細(xì)胞因子、吞噬和清除異物等多種功能,其功能異常與多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。持續(xù)高血糖狀態(tài)會(huì)促使腎小球系膜細(xì)胞增殖，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖越明顯。DKD 是病理以腎臟肥大、細(xì)胞外基質(zhì)積聚，腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化為特征的疾病。DKD 的主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的積聚擴(kuò)張伴隨系膜細(xì)胞增殖而出現(xiàn)[6,7]。腎臟系膜細(xì)胞增殖、肥大、細(xì)胞外基質(zhì)積聚擴(kuò)張導(dǎo)致腎小球硬化、纖維化[8]。FN 主要由系膜細(xì)胞產(chǎn)生,是系膜基質(zhì)的重要成分之一,多項(xiàng)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均表明高糖可以誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖維連接蛋白、膠原合成明顯增加[9～12]。因此，抑制腎小球系膜細(xì)胞FN 的表達(dá),有利于減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,阻止或延緩腎小球硬化的進(jìn)程。

p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，研究研究提示,p38MAPK 是細(xì)胞信號(hào)傳遞的交匯點(diǎn),多種糖尿病狀態(tài)都能誘導(dǎo)p38MAPK 激活[13]。從而引起細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡，這可能是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的共同通路。p38MAPK 主要表達(dá)在腎小球系膜細(xì)胞中，DN 患者p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞的高表達(dá)雖然與腎小球損傷程度不相平行，但與腎間質(zhì)損傷程度成正比[14]。研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病早期腎小球和高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中，p38MAPK 蛋白表達(dá)增加，磷酸化后活性增強(qiáng)[15]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[16]STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球p38MAPK 蛋白表達(dá)增加，磷酸化后活性增強(qiáng)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子CREB 活性增高和FN 蛋白表達(dá)增加。高濃度葡萄糖能夠激活腎小球系膜細(xì)胞p38MAPK 和CREB，使其磷酸化水平明顯增高，提示此信號(hào)途徑可能參與了糖尿病腎病的發(fā)病過(guò)程[17]。在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中，磷酸化p38MAPK 和磷酸化CREB 表達(dá)增加，F(xiàn)N表達(dá)增多，抑制p38MAPK后相應(yīng)的CREB磷酸化水平降低，F(xiàn)N 表達(dá)減少，p38MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)成分——纖維連接蛋白的合成過(guò)程[18]。p38MAPK 與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)增強(qiáng)、細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚等病理過(guò)程密切相關(guān)，p38MAPK 信號(hào)通路的激活在糖尿病腎病早期肥大和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的病變過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。一旦p38MAPK被激活將使其下游轉(zhuǎn)錄因子CREB 上的絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，CREB 磷酸化后進(jìn)入胞核與cAMP 反應(yīng)元件（CRE）結(jié)合，從而啟動(dòng)促纖維化細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相關(guān)基因表達(dá)[19]。在細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分FN 啟動(dòng)子-170bp 處含有1 個(gè)CRE，激活后的CREB 就能與該部位的CRE 結(jié)合、啟動(dòng)纖維連接蛋白mRNA 的表達(dá)[20,21]。阻斷p38MAPK 的活性有助于阻斷DKD 的發(fā)生和發(fā)展[22]。加味芪黃飲干預(yù)后發(fā)現(xiàn)加味芪黃飲能抑制p38MAPK 磷酸化水平,相應(yīng)地CREB 磷酸化減少和FN蛋白表達(dá)明顯減少,提示加味芪黃飲減少高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分——纖維連接蛋白的作用與其降低p38MAPK 及其轉(zhuǎn)錄因子CREB 磷酸化水平從而抑制p38MAPK 信號(hào)通路激活密切相關(guān)。

綜上所述，高糖能誘導(dǎo)大鼠腎小球p38MAPK 蛋白表達(dá)增加，磷酸化后活性增強(qiáng)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子CREB 活性增高和FN 蛋白表達(dá)增加；p38MAPK 特異性阻斷劑SB203580 能抑制p38MAPK 磷酸化水平,相應(yīng)地CREB 磷酸化減少和FN 蛋白表達(dá)明顯減少；加味芪黃飲高劑量組對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)FN 的蛋白表達(dá)水平、p38MAPK、CREB 的磷酸化水平下調(diào)作用優(yōu)于加味芪黃飲低劑量組；加味芪黃飲對(duì)p38MAPK、CREB 的磷酸化水平下調(diào)作用優(yōu)于SB203580。加味芪黃飲可能是通過(guò)下調(diào)p38MAPK 信號(hào)通路的表達(dá)及減少細(xì)胞外基質(zhì)成分FN 的積聚,產(chǎn)生相應(yīng)的腎臟保護(hù)作用，從而達(dá)到對(duì)糖尿病腎病的治療作用。

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