郭曉強(qiáng)

講師，解放軍白求恩軍醫(yī)學(xué)院生化教研室，石家莊 050081

基因合成的奠基人
——哈爾·戈賓德·科拉納

郭曉強(qiáng)

講師，解放軍白求恩軍醫(yī)學(xué)院生化教研室，石家莊 050081

科拉納；遺傳密碼；基因合成；諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

1953年，沃森和克里克DNA雙螺旋模型的提出標(biāo)志著分子生物學(xué)的誕生，而1958年克里克提出中心法則，進(jìn)一步闡述了 DNA發(fā)揮信息載體功能的機(jī)制。DNA中的遺傳信息需要轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)信息才可實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能，這其中涉及到一個(gè)關(guān)鍵問題，即DNA(或 RNA)中的堿基序列決定蛋白質(zhì)中氨基酸序列的秘密，科學(xué)家將“堿基順序決定氨基酸順序”這一特性稱為遺傳密碼。20世紀(jì)60年代，破譯遺傳密碼成為當(dāng)時(shí)分子生物學(xué)領(lǐng)域最迫切需要解決的重大問題之一。1961年，美國國立衛(wèi)生研究院的科學(xué)家尼倫伯格(Marshall Warren Nirenberg)首先應(yīng)用大腸桿菌無細(xì)胞體系確定了第一個(gè)遺傳密碼，即UUU編碼苯丙氨酸[1]。1966年，所有 64種遺傳密碼全部破譯成功，世界多位科學(xué)家為此做出了卓越貢獻(xiàn)，有兩位科學(xué)家發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，除尼倫伯格外，另一位就是美國籍印度裔科學(xué)家哈爾·戈賓德·科拉納(Har Gobind Khorana)[2]。

熱愛學(xué)術(shù)

哈爾·戈賓德·科拉納(1922—2011)

1922年1月9日，科拉納出生于印度旁遮普邦(Punjab)一個(gè)僅有100戶左右的小村莊萊布爾(Raipur, 現(xiàn)屬巴基斯坦)?？评{是家中的幼子，上面還有三個(gè)哥哥和一個(gè)姐姐，父親是英國殖民政府的一位農(nóng)業(yè)稅收員，但收入微薄，因此家庭非常貧困。盡管并不富裕，但科拉納父母意識(shí)到教育的重要性，鼓勵(lì)孩子們努力學(xué)習(xí)，并盡他們所能為科拉納等提供最好的學(xué)習(xí)環(huán)境?？评{的早期教育條件非常簡陋，由村里一位鄉(xiāng)村教師在一個(gè)室外教室(所謂教室也就是在大樹下搭建的簡易裝置)講課，在這種艱苦條件下科拉納完成了自己的初等教育。隨后，科拉納在木爾坦(Multan)完成自己的高中教育，并順利考入位于印度拉合爾(Lahore)的旁遮普大學(xué)。

1943年，科拉納以優(yōu)異成績從旁遮普大學(xué)畢業(yè)，并獲得理學(xué)學(xué)士學(xué)位(專業(yè)為化學(xué))，兩年后又獲得碩士學(xué)位(專業(yè)為生物化學(xué))。大學(xué)期間，科拉納一直努力學(xué)習(xí)、刻苦鉆研，取得卓越成績，畢業(yè)后幸運(yùn)獲得印度政府獎(jiǎng)學(xué)金，從而得以進(jìn)入英國利物浦大學(xué)進(jìn)行博士學(xué)習(xí)。在利物浦大學(xué)，科拉納跟隨導(dǎo)師比爾(Roger J. S. Beer)教授主要進(jìn)行生物堿合成和細(xì)菌色素紫色桿菌素(violacein) 的結(jié)構(gòu)研究，憑借這些成果于1948年獲得有機(jī)化學(xué)博士學(xué)位，期間他還對(duì)核酸生物化學(xué)產(chǎn)生了濃厚興趣。畢業(yè)后，科拉納在既沒有推薦信也沒有推薦人的情況下只身來到瑞士蘇黎士聯(lián)邦理工學(xué)院(Federal Institute of Technology, ETH)，找到著名有機(jī)化學(xué)大師普雷洛格(Vladimir Prelog，1975年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者)尋找博士后職位，普雷洛格在看過科拉納博士期間研究工作后同意他留下，但是無法提供科研基金。在隨后的11個(gè)月時(shí)間里，科拉納居住在實(shí)驗(yàn)室，主要靠大米和未消毒牛奶為生，盡管如此，科拉納與普雷洛格建立了長期的科研聯(lián)系，認(rèn)為是影響自己將來科學(xué)研究和思維的最偉大導(dǎo)師。當(dāng)時(shí)，科拉納對(duì)有機(jī)化學(xué)方面的進(jìn)展缺乏詳細(xì)的理解，因此花費(fèi)大量時(shí)間在圖書館查閱德國有機(jī)化學(xué)方面的文獻(xiàn)，偶然發(fā)現(xiàn)一種鮮為人知的合成試劑——碳二亞胺(carbodiiide)。這種試劑并未引起太多研究人員的注意，在英文文獻(xiàn)中幾乎找不到有關(guān)這種試劑的描述。盡管當(dāng)時(shí)科拉納也不知道這種試劑的具體用途，但在將來的研究中正是這種試劑為他的成功發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[3]。

核酸合成研究

1949年，科拉納為了履行早期獎(jiǎng)學(xué)金的要求而返回印度，但當(dāng)時(shí)分區(qū)后的印度使科拉納的家鄉(xiāng)劃歸到了巴基斯坦，親人也已失散，科拉納不得不暫時(shí)住在新德里的叔叔家。科拉納花了幾乎一年時(shí)間在尋找著工作，但當(dāng)時(shí)印度無法為他提供學(xué)術(shù)研究方面的職位，因此無果而終[4]。印度政府最終決定免除科拉納履行獎(jiǎng)學(xué)金的義務(wù)，與此同時(shí)科拉納在一位教授推薦下獲得英國劍橋大學(xué)托德爵士(Lord Alexander Todd，1957年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者)提供的博士后職位。

1950年，科拉納在親戚東拼西湊買到船票情況下又只身回到英國，開始了進(jìn)一步的科學(xué)研究。當(dāng)時(shí)劍橋已成為蛋白質(zhì)和核酸生物化學(xué)研究的國際中心，托德爵士剛剛闡明了DNA分子中核苷酸的化學(xué)連接方式，沃森和克里克于1953年提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，桑格于1955年闡明胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，這些進(jìn)展都極大激發(fā)了科拉納對(duì)生物大分子的研究興趣。在劍橋大學(xué)，科拉納開始將碳二亞胺應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)合成，如可激活多肽羧基端，可合成具有生物學(xué)活性的焦磷酸化合物等。

1952年，加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)研究委員會(huì)主任施勒姆(Gordon M. Shrum)訪問了劍橋大學(xué)，并請(qǐng)求托德推薦一位化學(xué)家到溫哥華開展學(xué)術(shù)研究，而科拉納幸運(yùn)地獲得了這次機(jī)會(huì)。在溫哥華，科拉納研究內(nèi)容較為自由，可開展自己喜歡的內(nèi)容，一方面研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，另一方面重點(diǎn)轉(zhuǎn)向研究核酸基本單位核苷酸的化學(xué)合成。1954年，科拉納應(yīng)用碳二亞胺合成了二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)。在隨后的時(shí)間里，科拉納及同事又先后合成了一系列的核苷酸化合物，包括環(huán)核苷酸、非對(duì)稱二核苷酸和另一些重要生物分子。最重大的進(jìn)展是 1959年，科拉納與莫法特(John G. Moffat)合作應(yīng)用碳二亞胺為原料合成乙酰 CoA[5]。乙酰CoA是當(dāng)時(shí)所知包含核苷酸的最復(fù)雜輔助因子，傳統(tǒng)方法是從酵母中提取，不僅耗時(shí)且價(jià)格昂貴，而科拉納化學(xué)合成的實(shí)現(xiàn)使乙酰CoA生產(chǎn)成本大大降低，從而有利于乙酰CoA的廣泛應(yīng)用，這項(xiàng)工作也使科拉納獲得了極高的國際聲譽(yù)。

科拉納在核苷酸生物合成方面的貢獻(xiàn)也引來大量著名生物化學(xué)家的造訪，如伯格(Paul Berg，1980年諾貝爾化學(xué)家獲得者)、科恩伯格(Arthur Kornberg，1959年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者)和肯尼迪(Eugene Kennedy)等，通過和這些科學(xué)家的溝通，科拉納也及時(shí)獲悉了生物化學(xué)方面的最新進(jìn)展。1955年，科拉納了解到奧喬亞(Severo Ochoa，1959年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者)發(fā)現(xiàn)了多聚核苷酸磷酸化酶，而科恩伯格也正在進(jìn)行DNA酶學(xué)方面的研究工作，這些成就都進(jìn)一步激發(fā)科拉納進(jìn)行核酸合成方面的研究。

遺傳密碼解析

1960年，科拉納加入美國威斯康星大學(xué)，成為酶學(xué)研究所的所長，1962年升任生物化學(xué)教授并于1964年成為Conrad A. Elvehjem生命科學(xué)講座教授。1961年，尼倫伯格第一種遺傳密碼的破譯促使許多科學(xué)家加入遺傳密碼的研究行列，科拉納也是其中之一?？评{擁有自己獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室和研究團(tuán)隊(duì)，前期研究使他擁有深厚的酶學(xué)知識(shí)背景、全面的核苷酸生物化學(xué)知識(shí)和嫻熟的寡核苷酸有機(jī)合成經(jīng)驗(yàn)，這些先決條件都為最終破譯遺傳密碼提供了強(qiáng)有力的保證。科拉納還是一位偉大的戰(zhàn)略型科學(xué)家和成功的科研管理者，他詳細(xì)制定了破譯遺傳密碼的策略，組織多名博士后共同參與到這個(gè)重大科學(xué)問題的解決之中。

科拉納將化學(xué)方法和酶學(xué)方法(DNA聚合酶和RNA聚合酶)有機(jī)結(jié)合來破譯遺傳密碼，到 1964年合成了包含64種(因?yàn)槭侨?lián)體密碼，所有共有43= 64種)可能遺傳密碼組合的核苷酸鏈，以這些寡聚核苷酸為模板在體外進(jìn)行多肽鏈的合成，根據(jù)合成出的多肽鏈中氨基酸順序來確定遺傳密碼。科拉納合成了一系列二核苷酸重復(fù)如多聚UC的多核苷酸鏈，該鏈只可能包含兩種遺傳密碼，即UCU和CUC，而最終獲得絲氨酸和亮氨酸交錯(cuò)排布的多肽，尼倫伯格研究小組已確定UCU為絲氨酸密碼，因此CUC則對(duì)應(yīng)亮氨酸密碼?？评{還進(jìn)一步合成了三核苷酸和四核苷酸重復(fù)的多核苷酸鏈，如UAC重復(fù)，則可能包含三種遺傳密碼UAC、ACU和CUA, 通過分析合成的多肽鏈中氨基酸順序和相關(guān)進(jìn)展最終確定了編碼20種氨基酸的61種遺傳密碼。更為重要的是，科拉納研究小組還發(fā)現(xiàn)，在四核苷酸重復(fù)的多核苷酸鏈中包含UAG、UGA和UAA時(shí)則只能合成二肽或三肽，無法生成更長的多肽鏈，從而確定這三種為終止密碼(尼倫伯格方法無法確定終止密碼)。到1966年，科拉納小組最終破譯了所有的遺傳密碼[6]。除破譯遺傳密碼外，科拉納還鑒定出多種遺傳密碼特征，如進(jìn)一步提供直接證據(jù)說明遺傳密碼為三聯(lián)體，RNA是 DNA到蛋白質(zhì)信息傳遞的中介分子(即 RNA 是蛋白質(zhì)合成模板)，RNA翻譯過程中遺傳密碼的閱讀方向；兩個(gè)密碼子之間既不存在間隔又不存在重疊(密碼連續(xù)性)。

1968年，科拉納和尼倫伯格以及霍利(Robert William Holley)由于“對(duì)遺傳密碼及其在蛋白質(zhì)合成過程方面作用的解釋”而分享該年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[7]。遺傳密碼的破譯及功能的闡明使人們對(duì)DNA作用有了更為全面的理解，從而大大推動(dòng)分子生物學(xué)的發(fā)展，這些工作還促進(jìn)了臨床的應(yīng)用，許多遺傳性疾病原來僅關(guān)心DNA變異，現(xiàn)在可在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行研究?；蚬δ茏罱K由表達(dá)出的蛋白質(zhì)來體現(xiàn)，因此遺傳密碼的破譯使人們更好地理解了遺傳性狀本質(zhì)。遺傳密碼破譯是20世紀(jì)60年代分子生物學(xué)領(lǐng)域最重大的進(jìn)展，它全面影響了生命科學(xué)，一方面拓展了對(duì)許多生命現(xiàn)象的理解，另一方面促進(jìn)了分子生物學(xué)的應(yīng)用，為基因工程誕生提供了關(guān)鍵性的基礎(chǔ)。

基因合成

一旦遺傳密碼的密碼被發(fā)現(xiàn)，科拉納的研究重點(diǎn)就轉(zhuǎn)移到基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)聯(lián)方面的研究，開始探索DNA蛋白質(zhì)之間存在的相互作用。為了更好理解基因表達(dá)，科拉納開始進(jìn)行DNA的合成和測序研究?？评{認(rèn)識(shí)到tRNA在蛋白質(zhì)合成過程中的重要性，決定首先人工合成編碼酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNAAla)相對(duì)應(yīng)的DNA。之所以選擇合成tRNAAla，一方面在于序列已知(1965年由霍利確定)，另一方面tRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列較短，合成難度相對(duì)較低。1970年6月，在威斯康星大學(xué)舉辦的一次生物化學(xué)家研討會(huì)上，科拉納宣布了自己的結(jié)果，第一次實(shí)現(xiàn)了酵母tRNAAla基因的化學(xué)全合成[8]，該成就被看作是分子生物學(xué)研究中的一個(gè)里程碑事件。

1970年夏，科拉納離開威斯康星大學(xué)，加入麻省理工學(xué)院(MIT)，成為生物學(xué)和生物化學(xué)Alfred P. Sloan講座教授，在這里一直工作到2007年退休?？评{對(duì)這次工作單位換動(dòng)的解釋是：如果你想讓你的智力長期保持活躍，你就應(yīng)該時(shí)常改變自己的環(huán)境。在麻省理工學(xué)院，科拉納繼續(xù)進(jìn)行基因合成研究。早期合成的酵母tRNAAla基因盡管可用于研究DNA 的轉(zhuǎn)錄和酶學(xué)，但不適合其他方面的研究，如轉(zhuǎn)錄起始和終止機(jī)制、RNA結(jié)構(gòu)功能的關(guān)聯(lián)等。為了解決該問題，科拉納和助手又著手進(jìn)行編碼大腸桿菌酪氨酸阻遏 tRNA前體的 DNA合成，該DNA由126個(gè)核苷酸殘基構(gòu)成，在合成過程中涉及到26個(gè)寡脫氧核苷酸片段的合成、多聚核苷酸連接酶催化的幾種片段連接以形成擁有合適互補(bǔ)單鏈末端的四個(gè)DNA雙鏈、將雙鏈連接而形成完整DNA等[9]。1976年，科拉納宣布合成了完全具有功能的人造基因[10]，該基因擁有表達(dá)需要的所有元件，可在大腸桿菌內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄。這是人類第一次實(shí)現(xiàn)人造基因，科拉納所發(fā)明的人工合成基因片段的方法一方面奠定了研究基因結(jié)構(gòu)決定功能機(jī)理研究的基礎(chǔ)，另一方面還成為基因工程的重要工具。今天，生物學(xué)家和生物化學(xué)家在進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變、基因克隆、DNA測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和其他實(shí)驗(yàn)等都廣泛應(yīng)用到合成的DNA。

20世紀(jì)80年代，科拉納又拓展了研究方向，重點(diǎn)對(duì)涉及到視覺感知的分子——視紫紅質(zhì)蛋白的化學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行研究[11]。科拉納研究小組合成了細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因，闡明了其在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中質(zhì)子運(yùn)輸機(jī)制和表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制?？评{仍然應(yīng)用多學(xué)科交叉的方法，包括生物化學(xué)、遺傳學(xué)、化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等來闡明哺乳動(dòng)物視覺感官系統(tǒng)和 G蛋白偶聯(lián)受體的作用機(jī)制，此外還研究了生物膜和生物能學(xué)等知識(shí)。

20世紀(jì)90年代，科拉納在視覺方面的工作促使發(fā)現(xiàn)了視紫紅質(zhì)基因突變造成的蛋白質(zhì)折疊異常是引發(fā)遺傳性色素視網(wǎng)膜炎失明的重要原因，對(duì)這些基因突變形式的研究有助于理解色素視網(wǎng)膜炎特定的臨床癥狀。

重要貢獻(xiàn)

科拉納不但是一位偉大的科學(xué)家，而且還是一位偉大的教育家，在培養(yǎng)年輕科學(xué)家方面也貢獻(xiàn)重要力量?？评{共指導(dǎo)了 150多名博士后和多名研究生，許多已成為世界重要學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)或生物技術(shù)公司的領(lǐng)導(dǎo)者?？评{一生發(fā)表450多篇論文，尤其是酵母tRNAAla基因合成論文于 1972年12月份《分子生物學(xué)雜志》整版刊登(共15篇，313頁)，也說明了科拉納的研究對(duì)科學(xué)界的重要性。

1966年，科拉納成為美國公民，他非常專注于自己的工作，很少離開工作崗位，一直不知疲倦地工作，曾經(jīng)連續(xù)十二年未曾度假。盡管已取得美國國籍，但科拉納還非常關(guān)注印度的發(fā)展，2007年，創(chuàng)立科拉納獎(jiǎng)學(xué)金計(jì)劃，這是一個(gè)在印度大學(xué)學(xué)生和威斯康星大學(xué)學(xué)者之間進(jìn)行交換的計(jì)劃。通過該計(jì)劃，許多威斯康星大學(xué)老師來到印度，而許多印度學(xué)生可進(jìn)入威斯康星大學(xué)深造，對(duì)提升印度教育具有十分重要的意義。

除獲得諾貝爾獎(jiǎng)外，科拉納還獲得大量重要獎(jiǎng)項(xiàng)和榮譽(yù)，如加拿大化學(xué)研究所授予的默克獎(jiǎng)(1958年)、Dannie-Heinneman獎(jiǎng)(1967年)、約翰霍普金斯大學(xué)授予的Remsen獎(jiǎng)(1968年)、由于合成有機(jī)化學(xué)創(chuàng)造性工作而獲得的美國化學(xué)學(xué)會(huì)獎(jiǎng)(1958年)、拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)(the Lasker Foundation Award for Basic Medical Research,1968年)、Willard Gibbs獎(jiǎng)(1974年)、美國國家科學(xué)獎(jiǎng)?wù)?1987)等，科拉納是美國科學(xué)院院士(1966年)、美國藝術(shù)和科學(xué)院院士、美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)會(huì)員、蘇聯(lián)科學(xué)院外籍院士(1971年)和印度化學(xué)學(xué)會(huì)榮譽(yù)會(huì)員(1974年)等。科拉納獲得多所學(xué)校授予的榮譽(yù)學(xué)位，如利物浦大學(xué)、英屬哥倫比亞大學(xué)、芝加哥大學(xué)和旁遮普大學(xué)等。

2011年11月9日，科拉納在美國馬薩諸塞州的康科德市(Concord) 去世，享年 89歲。去世后，科拉納的學(xué)生和同事在多家雜志上發(fā)表訃告懷念這位科學(xué)大師[2-4,12-13]，此外多家報(bào)紙如《紐約時(shí)報(bào)》和《華盛頓郵報(bào)》等也刊登了相關(guān)文章?？评{是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一位巨人，MIT生物系主任凱撒(Chris Kaiser)將科拉納評(píng)價(jià)為“一位杰出且具開創(chuàng)精神的科學(xué)家”。

遺傳密碼破譯和基因人工合成是20世紀(jì)生命科學(xué)中的重大突破，科拉納對(duì)推動(dòng)分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，因此撰寫此文以示對(duì)科拉納教授的懷念。

(2012年3月19日收稿)

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Founder of gene synthesis:Har Gobind Khorana

GUO Xiao-qiang
Lecturer，Department of Biochemistry，Bethune Military Medical College，Shijiazhuang 050081，China

Khorana, genetic code,gene synthesis, Nobel prize in physiology or medicine

10.3969/j.issn.0253-9608.2013.02.010

(編輯：溫文)